2. Phương phỏp nghiờn cứu
1.3.1. Cấu tạo cảm biến huỳnh quang dựa trờn QD và enzyme
1.3.1.1. Đầu thu sinh học
Đầu thu sinh học là phần cú phản ứng trực tiếp với cỏc loại tỏc nhõn cần phỏt hiện và cú nguồn gốc sinh học. Dựa vào cỏc tỏc nhõn sinh học sử dụng, người ta sử dụng một số loại đầu thu khỏc nhau, phổ biến nhất là cỏc enzyme. Trong trường hợp này chỳng tụi sử dụng enzyme AChE.
1.3.1.2. Bộ phận chuyển đổi tớn hiệu
Đõy là bộ phận quan trọng trong cảm biến sinh học. Cú nhiều dạng chuyờ̉n đổi như chuyờ̉n đổi điện húa, chuyờ̉n đổi quang, chuyờ̉n đổi nhiệt, chuyờ̉n đổi bằng tinh thờ̉ ỏp điện hoặc chuyờ̉n đổi bằng cỏc hệ vi cơ.
Chuyờ̉n đổi quang là chuyờ̉n đổi hoạt động dựa trờn cỏc hiệu ứng như: hấp thụ ỏnh sỏng nhỡn thấy hoặc tia UV; phỏt xạ huỳnh quang, bio-luminescence; chemi-luminescence [115]. Cỏc tỏc nhõn cố định là một phần rất quan trọng trong
cảm biến sinh học. Cỏc tỏc nhõn này cú nhiệm vụ gắn kết cỏc đầu thu sinh học lờn trờn đế. Núi cỏch khỏc đõy là bộ phận trung gian cú tỏc dụng liờn kết cỏc thành phần sinh học (cú nguồn gốc từ cơ thờ̉ sống) với thành phần vụ cơ là QD.
1.3.1.3. Enzyme acetylcholinesterase (AChE)
Enzyme là những chất xỳc tỏc sinh học, cú thờ̉ là protein hoặc acid nucleic, cú đầy đủ tớnh chất của một chất xỳc tỏc, ngoài ra cũn cú những tớnh chất ưu việt hơn so với cỏc chất xỳc tỏc khỏc như: hiệu suất cao tại nhiệt độ và ỏp suất bỡnh thường, cú tớnh chất đặc hiệu cao [13, 88]. Cỏc tớnh chất này vẫn được giữ nguyờn khi tỏch enzyme ra khỏi hệ thống sống, và cho hoạt động trong điều kiện ống nghiệm (invitro). Vỡ vậy mà enzyme ngày càng được sử dụng rộng rói trong thực tế, trong cụng nghiệp… Do đú đó hỡnh thành nờn nhiều ngành liờn quan đến enzyme như cụng nghệ sản xuất enzyme, cụng nghệ sản xuất cỏc thiết bị cú chứa enzyme [112, 131].
Mỗi loại enzyme chỉ xỳc tỏc cho một phản ứng nhất định với cơ chất tương ứng [70]. Enzyme cú khả năng xỳc tỏc một cỏch hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ và ỏp suất bỡnh thường, trong khi cỏc chất xỳc tỏc khỏc lại thường đũi hỏi nhiệt độ và ỏp suất cao, mà hiệu quả phản ứng lại khụng cao. Sở dĩ enzyme cú khả năng tuyệt vời như vậy vỡ nú tạo ra được mụi trường đặc hiệu, cú lợi nhất về mặt năng lượng đờ̉ thực hiện phản ứng. Mụi trường đặc hiệu trờn được tạo bởi tõm hoạt động liờn kết với cơ chất mà nú xỳc tỏc tạo ra phức enzyme-cơ chất.
Enzyme cú cường độ xỳc tỏc đặc hiệu rất cao bởi vỡ năng lượng tự do giải phúng trong quỏ trỡnh hỡnh thành liờn kết yếu trong tương tỏc liờn kết cơ chất enzyme. Enzyme thường sử dụng năng lượng liờn kết làm giảm năng lượng hoạt hoỏ. Theo Bruchez [76], giả thuyết về “sự ăn khớp như chỡa khoỏ và ổ khoỏ” (hỡnh 1.13) cho phộp giải thích tính xỳc tỏc đặc hiệu của enzyme. Tuy nhiờn, khụng thờ̉ dựa vào đú đờ̉ giải thích cơ chế hoạt động của enzyme, vỡ trong thực tế sự khớp quỏ khăng khít này lại là nguyờn nhõn cản trở diễn tiến phản ứng.
Hỡnh 1.13. Sơ đồ mụ tả tớnh đặc hiệu của enzyme [76]
Enzyme acetylcholinesterase (AChE) được tạo thành từ 12 lớp xoỏy beta kết chặt được bao bọc bởi 14 vũng xoắn ốc anpha (hỡnh 1.14) [127]. Tõm hoạt động là phần rónh sõu, kộo dón ở khoảng giữa của protein. Rónh đú được tạo bởi bó thơm, bó này giỳp ổn định ion amoni bậc bốn trong acetylcholine.
Đối với AChE, kết quả thực nghiệm đó xỏc nhận sự tạo phức giữa nú và cơ chất. Tõm hoạt động là nhúm bộ ba Ser (200)-His (440)-Glu (327) [67]. Phản ứng xảy ra tại một hốc sõu bờn trong phõn tử AChE. Phõn tử cơ chất trước tiờn phản ứng với tõm xỳc tỏc (nhúm OH trờn Ser (200)) đờ̉ tỏch ra choline, sau đú tõm xỳc tỏc đó bị axetyl húa sẽ tỏi tạo lại bằng cỏch phản ứng với phõn tử nước.
Hỡnh 1.14. Mụ phỏng acetylcholinesterase (AChE) với cấu trỳc đơn vị aminoaxit Ser(200), His (440), Glu (327) [110]
Sự ức chế AChE tại tõm hoạt động Ser (200) dần làm mất tỏc dụng hoàn toàn dẫn đến sự ngăn chặn quỏ trỡnh thủy phõn của ATCh.
Với cỏc trường hợp nồng độ cỏc cơ chất, nghĩa là nồng độ QD khụng thay đổi trong cỏc thớ nghiệm thỡ sự ức chế enzyme bị ảnh hưởng bởi một số cỏc yếu tố như:
a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuuyến tớnh vào nồng độ cơ chất: vk. E ; Trong đú: : vận tốc phản ứng, E : nồng độ cơ chất. Cú trường hợp khi nồng độ enzyme quỏ lớn thỡ tốc độ phản ứng chậm.
b) Ảnh hưởng của chất ức chế: Cỏc chất ức chế I là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xỳc tỏc. Cỏc chất ức chế này cú thờ̉ là ion, chất vụ cơ, chất hữu cơ, cú thờ̉ là cơ chất hay sản phẩm của phản ứngE. Kiờ̉u tỏc dụng bao gồm đặc hiệu hay khụng đặc hiệu. Và kỡm hóm thuận nghịch hay khụng thuận nghịch.
c) Ảnh hưởng của cỏc ion kim loại: Ion kim loại cú thờ̉ kỡm hóm hoặc hoạt hoỏ cỏc enzyme. Cỏc ion kim loại nặng ở nồng độ gõy biến tớnh protein cú tỏc dụng kỡm hóm khụng thuận nghịch. Tỏc dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chỳng. Và giới hạn này là khỏc nhau cho từng loại ion riờng biệt. Tỏc dụng của ion kim loại cú mối quan hệ qua lại giữa pH của enzyme và cơ chất. Tỏc dụng hoạt hoỏ ion kim loại cú tính đặc hiệu, mỗi ion kim loại thường hoạt hoỏ cỏc enzyme xỳc tỏc cho một kiờ̉u phản ứng nhất định và cũng thay đổi tuỳ ion.
d) Ảnh hưởng của pH: Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH mụi trường và pH ảnh hưởng đến trạng thỏi ion hoỏ của cỏc gốc trong phõn tử emzyme, ion hoỏ cỏc nhúm chức trong trung tõm hoạt động, ion hoỏ cơ chất dẫn đến ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng. pH thớch hợp của phần lớn enzyme vào khoảng 7. Độ bền của phõn tử enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thỏi ion hoỏ của phõn tử, phần lớn enzyme bền trong khoảng 5<pH<9. Bản chất hoỏ học của thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hưởng tới độ bền, hoạt độ xỳc tỏc của enzyme.
e) Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ hoạt động thớch hợp của nhiều enzyme vào khoảng 35ữ50oC. Trờn 50oC hoạt độ thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trỳc phõn tử enzyme. Ở khoảng 70oC thỡ phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tớnh, gọi là nhiệt độ tới hạn. Trong khoảng nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tớnh, hiếm khi hồi phục lại được.
f) Đơn vị đo hoạt độ xỳc tỏc của enzyme: Đơn vị u (unit). Một đơn vị u là hoạt độ của một enzyme ở điều kiện tiờu chuẩn thớch hợp, xỳc tỏc cho phản ứng chuyờ̉n húa một mol cơ chất trong một phỳt. 1 u = 1 cơ chất/phỳt = (10-6 mol/60 giõy)
Đơn vị Katal (viết tắ là kat): Một đơn vị kat là lượng enzyme xỳc tỏc cho phản ứng chuyờ̉n húa một mol cơ chất trong một giõy ở cỏc điều kiện phõn tớch (đơn vị kat ít được dựng). 1 kat = 1 mol/giõy (1kat = 60 x 106u).
1.3.1.4. Chất chỉ thị acetylthiocholine (ATCh)
Acetylthiocholine là một trong những tỏc nhõn dẫn truyền thần kinh quan trọng trong hệ thần kinh của động vật cú vỳ. Nú đó được tỡm thấy ở tất cả cỏc mối nối thần kinh, ở tất cả cỏc khớp thần kinh trung ương và cỏc cơ quan ngoại vi. ATCh cú nhiệm vụ mang tớn hiệu từ cỏc tế bào thần kinh tới tế bào cơ. Khi một tế bào thần kinh vận động nhận được tớn hiệu từ trung khu thần kinh, nú sẽ tiết ra ATCh đi vào cỏc synap giữa cỏc tế bào thần kinh vận động và tế bào cơ [7, 15]. Tại đõy ATCh kích hoạt cỏc thụ quan trong tế bào cơ, phỏt động quỏ trỡnh co cơ. Khi tín hiệu đó được truyền đi thỡ ATCh cần phải bị phỏ hủy, nếu khụng nú sẽ tiếp tục tỏc động đến cỏc thụ quản của tế bào cơ và tín hiệu sẽ bị chồng lấn lờn nhau. AChE cú mặt tại cỏc synap giữa tế bào thần kinh và tế bào cơ, đảm nhận chức năng phỏ hủy ATCh ngay sau khi tớn hiệu được truyền đi. Dưới tỏc dụng của AChE, ATCh bị thủy phõn thành axit axetic và thiocholine (hỡnh 1.15). Sau đú thiocholine sẽ được quay vũng đờ̉ chuyờ̉n lại thành ATCh. Như vậy, việc điều tiết AChE đảm bảo cho hoạt động thần kinh diễn ra nhịp nhàng, chớnh xỏc.
Hỡnh 1.15. Sơ đồ quỏ trỡnh thủy phõn ATCh [36]
Khi ATCh được thủy phõn sẽ tạo ra axit acetic và thiocholine (TCh). Nếu quỏ trỡnh này AChE bị ức chế, ATCh sẽ khụng được thủy phõn và ứ đọng lại trong cơ thờ̉. Kết quả là sự dẫn truyền thần kinh sẽ bị tắc nghẽn dẫn tới việc khụng ngắt truyền xung tớn hiệu. Điều này cú thờ̉ tạo ra co thắt, tờ liệt cỏc hệ cơ trong cơ thờ̉.
1.3.1.5. Hệ liờn kết sinh học avidin – biotin
Avidin cú thờ̉ gắn kết với biotin với một ỏi lực mạnh [67, 132]. Khi hai phõn
tử này cựng ở trong một dung dịch, chỳng sẽ kết hợp chặt chẽ với nhau và về cơ bản là khụng thay đổi. Sự hỡnh thành liờn kết này diễn ra rất nhanh và nhạy với khoảng rộng của độ pH, nhiệt độ, dung mụi hữu cơ và tỏc nhõn biến tính. Chỳng cũng khụng bị mất đi sau khi rửa. Lợi dụng ỏi lực cao giữa hai phõn tử này, nhiều cụng trỡnh [23, 67, 77, 132] đó khai thỏc sử dụng biotin đờ̉ gắn vào khỏng thờ̉ và khỏng thờ̉ được gắn biotin cú thờ̉ kết hợp với nhiều avidin.
Hỡnh 1.16. Mụ hỡnh mụ tả liờn kết sinh học giữa avidin và biotin (a) và tương tỏc tĩnh điện giữa SA và nhúm chức COOH-[74, 140]
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp biến đổi bề mặt QD với nhúm chức carboxyl COOH-. Mục đích là đờ̉ cỏc QD phõn tỏn được trong nước và tạo liờn kết với phõn tử SA thụng qua tương tỏc tĩnh điện, là một trong những tương tỏc mạnh giữa cỏc phõn tử sinh học (bảng 1.2), sau đú enzym AChE được gắn nối với SA bằng liờn kết avidin – biotin này (hỡnh 1.16).