2. Phương phỏp nghiờn cứu
5.2.1. Qui trỡnh chung để ghi phổ huỳnh quang của cảm biến đó chế tạo
Nguyờn lý của cảm biến của nghiờn cứu này là đo sự thay đổi của tớn hiệu huỳnh quang, dựa trờn cơ sở phản ứng thủy phõn của ATCh trong mụi trường nước khi cú sự xỳc tỏc của enzyme AChE. Như đó đề cập ở chương 1, hoạt độ đó được xỏc định với mỗi đơn vị của AChE, 1 mol ATCh sẽ bị thủy phõn trong 1 phỳt. Khi cú mặt của thuốc trừ sõu, enzyme AChE sẽ bị ức chế mạnh và phản ứng thủy phõn
ATCh sẽ khụng xảy ra. Từ đú cú thờ̉ xỏc định sự tồn tại của dư lượng bằng cỏch giỏn tiếp, thụng qua sự thay đổi mụi trường xung quanh bề mặt QD và ảnh hưởng tới tớnh chất phỏt xạ huỳnh quang của cỏc QD. Lượng AChE dựng tương ứng với 2 u là 122 àl, cũng được giữ khụng đổi, được gắn lờn QD. Lượng thuốc trừ sõu với cỏc nồng độ khỏc nhau được phõn tỏn trong nước đờ̉ khảo sỏt.
Sau khi gắn enzyme AChE lờn QD, tạo được cấu trỳc QD-SA-AChE, phõn tỏn QD-SA-AChE vào nước với thờ̉ tích đó được tớnh toỏn sao cho thờ̉ tớch tổng của bước cuối là 2 ml. Hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 phỳt. Quỏ trỡnh này tạo điều kiện thớch hợp đờ̉ enzyme hoạt động. Bước tiếp theo, chỳng tụi tạo hỗn hợp ATCh và thuốc trừ sõu với cỏc nồng độ xỏc định. Đờ̉ tiến hành khảo sỏt, hỗn hợp ATCh và thuốc trừ sõu được đổ vào hỗn hợp cảm biếnQD-SA-AChE và ghi phổ huỳnh quang cỏc mẫu ngay sau đú.
Yờu cầu quan trọng trong qui trỡnh chung đờ̉ cảm biến hoạt động hiệu quả là giữ cố định nồng độ QD. Ở đõy chỳng tụi lựa chọn nồng độ 0,3 mol/ml và thờ̉ tớch tổng cộng cuối cựng cho mỗi mẫu là 2 ml. Đõy là nồng độ cơ chất thớch hợp đờ̉ sự hoạt động của lượng enzyme cú hoạt độ 2 u. Nội dung này được trỡnh bày tại mục 1.3.2. Tựy theo thờ̉ tớch của cỏc tỏc nhõn thay đổi mà thờ̉ tích nước thay đổi. Giỏ trị của độ pH khoảng 7,4 khi chưa cú thuốc trừ sõu và ATCh. Dung dịch thuốc trừ sõu phải được đưa vào cảm biến đồng thời cựng với ATCh đờ̉ đảm bảo sự xuất hiện đồng thời của chất gõy ức chế enzyme và chất mà enzyme đặc hiệu xỳc tỏc [114]. Đờ̉ xỏc định nồng độ thuốc trừ sõu thử nghiệm, chỳng tụi theo cỏc tiờu chuẩn nồng độ dư lượng thuốc trừ sõu trờn nụng sản cho phộp đó trỡnh bày ở phần trờn [31], từ 0,01 đến 5 ppm, và một số trường hợp thử nghiệm với nồng độ nhỏ hơn.
Hỡnh 5.2 mụ tả nguyờn lý phỏt hiện thuốc trừ sõu với hai trường hợp: ễ nột đứt trờn (5.2a) mụ tả trường hợp khụng cú thuốc trừ sõu, phản ứng thủy phõn ATCh xảy ra trong mụi trường nước với sự xỳc tỏc của AChE, sinh ra TCh và CH3COOH, làm thay đổi mụi trường chứa QD. Và ụ nột đứt dưới (5.2b) biờ̉u thị sự ức chế của enzyme AchE khi cú sự xuất hiện của thuốc trừ sõu và phản ứng thủy phõn của ATCh khụng xảy ra.
Hỡnh 5.2. Sơ đồ mụ tả nguyờn lý xỏc định thuốc trừ sõu của cảm biến sử dụng QD và AChE
Với cơ chế phỏt hiện này, enzyme AChE xỳc tỏc phản ứng thủy phõn bằng cỏc nhúm hydroxyl tại cỏc tõm hoạt động, tấn cụng vào cỏc nguyờn tử phospho, bắt cỏc điện tử rời khỏi liờn kết O-P, làm cho nguyờn tử phospho hoạt động mạnh lờn, phản ứng diễn ra nhanh hơn. Ngược lại, độc tớnh của thuốc trừ sõu, điờ̉n hỡnh trong đú là parathion methyl, gốc OP và carbosulfan gốc carbamate, là cỏc hợp chất ức chế khụng thuận nghịch enzyme AChE mạnh nhất [6, 49], thụng qua sự hỡnh thành liờn kết đồng hoỏ trị P – O tại nhúm hydroxyl của tõm hoạt động serine của enzyme (hỡnh 5.3) [17, 36, 67].
Hỡnh 5.3. Cơ chế ức chế enzyme AChE bởi parathion metyl (organophosphate) và carbosulfan (carbamate) [33].
Parathion methyl Carbosulfan
(a)
Trờn cơ sở cỏc kết quả phõn tớch cỏc tớnh chất quang ở chương 3, chỳng tụi đó tập trung vào khai thỏc, sử dụng một số loại QD hai thành phần cấu trỳc lừi/vỏ, lừi/đệm/vỏ đó được chế tạo là CdSe/ZnS (10; 14 ML), CdSe/ZnSe 2 ML/ZnS (4,4; 8 ML) và QD ba thành phần CdZnSe/ZnS 6 ML đờ̉ chế tạo cảm biến.
Sự thay đổi độ pH mụi trường đó ảnh hưởng cục bộ đến điện tớch trờn bề mặt cỏc QD [81, 97, 116]. Bờn cạnh đú, sự thay đổi cỏc ligand của QD và sự truyền năng lượng cộng hưởng FRET và BRET từ QD tới phõn tử hữu cơ là chất nhận điện tử và ngược lại đó làm thay đổi tớnh chất phỏt huỳnh quang của tổ hợp chứa QD khi cú sự xuất hiện của thuốc trừ sõu [21, 47, 92].