2. Phương phỏp nghiờn cứu
5.1. Giới thiệu chung về thuốc trừ sõu sử dụng trong luận ỏn
Cỏc loại thuốc trừ sõu này cú ưu điờ̉m là diệt sõu bệnh, cỏ dại một cỏch nhanh chúng, sử dựng lại đơn giản [6, 9, 10]. Tuy nhiờn, cỏc loại thuốc trừ sõu đều cú độc
tớnh cao. Trong quỏ trỡnh sử dụng thuốc trừ sõu, một lượng thuốc nào đú cú thờ̉ đi vào trong thõn cõy, quả, hoặc dớnh bỏm chặt trờn lỏ, quả. Người và động vật cú thờ̉ bị ngộ độc tức thời, hoặc nhiễm độc, gõy ảnh hưởng đến sức khoẻ [123, 124].
Trong chương này, một số kết quả thử nghiệm xỏc định dư lượng một số loại thuốc trừ sõu dựng cỏc cảm biến huỳnh quang được chế tạo dựa trờn cơ sở cỏc loại QD sẽ được trỡnh bày. Chỳng tụi cũng trỡnh bày về ngưỡng nồng độ cần được phỏt hiện của một vài loại thuốc trừ sõu, và giới hạn phỏt hiện được trờn thực tế của cỏc cảm biến sinh học huỳnh quang chế tạo được trong nghiờn cứu này.
5.1.1. Phõn loại thuốc trừ sõu
Cú nhiều cỏch phõn loại thuốc trừ sõu. Cú thờ̉ phõn loại thuốc trừ sõu đối tượng cụn trựng cần tiờu diệt: vớ dụ như thuốc diệt cụn trựng, sõu bọ hay thuốc diệt nấm… Hoặc cỏch khỏc là phõn loại theo mức độ rủi ro về độc hại, cú bốn mức khỏc nhau theo phõn loại của Tổ chức Y tế thế giới. Trong nội dung nghiờn cứu này, căn cứ trờn danh mục thuốc trừ sõu được phộp sử dụng tại Việt Nam (Bảng 5.1) [1], chỳng tụi tập trung nghiờn cứu phỏt hiện một số loại thuốc trừ sõu phổ biến và cú cơ chế gõy độc gần giống nhau thuộc cỏc nhúm: lõn hữu cơ (organophosphorus - OP), carbamate, pyrethroit, neonicotinoid và thuốc trừ sõu sinh học (hỡnh 5.1).
Bảng 5.1. Cỏc thuốc trừ sõu đó sử dụng trong thực nghiệm luận ỏn.
Nhúm Tờn hoạt chất Cụng thứchúa học Lõn hữu cơ (Organophosphorus) Parathion methyl C10H14NO5PS Trichlorfon C4H8Cl3O4P Carbamate Carbosulfan C10H11ClN4 Neonicotinoids Acetamiprid C22H19Cl2NO3 Cỳc tổng hợp (Pirethroit) Cypermethrin C48H72O14
Hỡnh 5.1. Mẫu thuốc trừ sõu trichlorfon, carbosulfan, cypermethrin, abamectin, do Cục BVTV, Bộ NN&PTNT cung cấp
5.1.2. Thuốc trừ sõu parathion metyl
Parathion methyl là một trong cỏc loại thuốc trừ sõu thuộc nhúm lõn hữu cơ (organophosphorus), là thành phần chớnh trong cỏc thuốc trừ sõu cú tờn thương mại là Wofatox 50EC, Danacap M25, M40, Folidol - M 50 EC…Đõy là loại thuốc trừ sõu độc nhúm I. Nú được sử dụng đờ̉ kiờ̉m soỏt sõu cuốn lỏ, rầy nõu, sõu đục thõn trờn lỳa, rau, quả và cõy mía…[6]. Cụng thức hoỏ học: C8H10NO5PS. (O,O-dimethyl O-(4-nitrophenyl) phosphorothioate).
Tớnh chất lý - húa: Parathion methyl là chất khụng màu, núng chảy ở 35 – 36oC, dễ bay hơi ở nhiệt độ mụi trường cao. Thủy phõn yếu trong mụi trường acid và trung tớnh, thủy phõn mạnh trong mụi trường kiềm. Sản phẩm cuối cựng của sự thủy phõn là H3PO4 và H2S. Parathion methyl dễ bị ỏnh sỏng và nhiệt độ phõn hủy.
Cơ chế gõy độc: Parathion methyl tỏc động mạnh lờn thần kinh điều khiờ̉n cơ. Khi cụn trựng hoặc người bị nhiễm độc, parathion methyl cú thờ̉ bị oxy húa thành paraoxon cú độ độc cao hơn, tỏc động mạnh lờn enzyme AChE.
5.1.3. Thuốc trừ sõu trichlorfon
Trichlorfon thuộc nhúm lõn hữu cơ. Là một trong cỏc thành phần của thuốc trừ sõu cú tờn thương mại Medophos 50EC, 750EC, Cobitox 5 GR, Ofatox 400EC, 400WP…Được sử dụng đờ̉ diệt sõu hại đậu xanh, sõu phao đục bẹ, sõu cuốn lỏ trờn lỳa, sõu gai, bọ xớt, bọ trĩ, rệp muội trờn rau, rầy xanh trờn lỏ chố…Cụng thức húa học: C4H6Cl3O4P. (O,O-dimethyl-1-(oxy-2,2,2 tricloethyl) phosphonas)
Tớnh chất vật lý - húa: Chất kết tinh màu trắng, nhiệt độ núng chảy 83 – 84 oC, hũa tan được trong nhiều dung mụi hữu cơ, tan khỏ trong nước (12,3g/100g nước ở 20
oC). Rất bền ở nhiệt độ phũng, bị phõn hủy trong mụi trường kiềm, khả năng ức chế cholinesterza phụ thuộc nhiều vào độ pH của mụi trường. Cơ chế gõy độc: Tương tự loại thuốc trừ sõu parathion metyl.
5.1.4. Thuốc trừ sõu carbosulfan
Carbosulfan thuộc gốc carbamate, là thành phần chớnh trong cỏc thuốc trừ sõu cú tờn thương phẩm Alfasulfan 5 GR, Hiddencard 250EC, Sulfaron 250EC…Nú cú phạm vi tỏc dụng rộng, trừ được nhiều loài cụn trựng. Nú thuộc nhúm độc I, (4EC) và II (2,5EC). Hiệu lực diệt sõu đục thõn trờn ngụ, cà phờ, lỳa, cam…Cụng thức húa học: C20H32N2O3S (2, 3-dihidro-2, 2-dimetyl-7- benzofuranyl [(dibu – tylamino) thiol] metylcacbamate).
Tớnh chất lý – húa: Nhiệt độ núng chảy: 59-61 °C, dễ bay hơi ở nhiệt độ phũng. Độ hũa tan: trong nước 100g là 66.6g, tan trong ethanol.
Tỏc động gõy độc: Độ độc thấp hơn nhúm lõn hữu cơ. Gõy độc cấp tớnh khỏ cao, tỏc động qua hệ thần kinh, tích lũy nhanh. Là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) [36, 142].
5.1.5. Thuốc trừ sõu acetamiprid
Acetamiprid là thuốc trừ sõu thuộc nhúm neonicotinoid, hoạt chất phổ biến trừ rầy hại lỳa. Hoạt chất này nằm trong cỏc tờn thương phẩm Newtoc 250EC, safari 250EC, Mopride 20WP…Đõy là thuốc đặc trị rầy nõu, sõu cuốn lỏ, diệt rầy xanh, nhện đỏ, bọ cỏnh tơ hại chố; rệp, bọ trĩ hại bụng, rầy nõu, bọ trĩ hại lỳa; rầy xanh, bọ cỏnh tơ hại chố [6, 72]. Cụng thức húa học: C8H10NO5PS(N-[(6-chloro-3- pyridyl)methyl]-N'-cyano-N-methyl-acetamidine).
Tớnh chất lý – húa: Khối lượng phõn tử khối 222.68 g/mol, thuộc nhúm độc II. Tỏc động gõy độc: Tỏc động thần kinh, cỏc cụn trựng bị xử lý thuốc sẽ run chi, chuyờ̉n động cỏnh nhanh, di chuyờ̉n vụ hướng, liệt và chết.
5.1.6. Thuốc trừ sõu cypermethrin
Cypermethrin thuộc gốc cỳc tổng hợp (pyrethroit), nằm trong cỏc thuốc trừ sõu thương phẩm Sherpa, Ambush C, Cymbush, Peran, Cyperan…Cypermethrin tỏc dụng tiếp xỳc và vị độc, cú phổ tỏc dụng rất rộng, trừ được nhiều loại sõu, đặc biệt là bộ cỏnh vẩy. Cụng thức húa học: C22H19Cl2NO3(RS)--cyano-3-phenoxibanzy (1RS,3RS;3RS)- 3-(2,2-diclo vinyl -2,2-dimetylxiclopropancaboxylat, khối lượng phõn tử 416,3.
Tớnh chất lý – húa: Thuốc dạng sệt, chuyờ̉n thành dạng dung dịch lỏng ở nhiệt độ 60 oC, tương đối bền trong mụi trường trung tớnh và axit nhẹ, thủy phõn trong mụi trường kiềm.
Cơ chế gõy độc: Tỏc động lờn hệ thống thần kinh, gõy ảnh hưởng đến sự vận chuyờ̉n của Na qua màng tế bào thần kinh, gõy nờn sự lặp đi lặp lại và kộo dài xung động thần kinh trong cơ quan cảm giỏc và làm đỡnh trệ xung động trong sợi thần kinh [72].
5.1.7. Thuốc trừ sõu abamectin
Abamectin là thuốc trừ sõu sinh học thế hệ mới, nguồn gốc sinh học, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phõn lập từ quỏ trỡnh lờn men của vi khuẩn Streptomycin avermitilis. Tỏc dụng phổ biến đờ̉ phũng trừ sõu hại trờn nhiều loại cõy trồng đặc biệt là rau, hoa, chố, lỳa. Cụng thức húa học: C48H72O14, thuộc nhúm độc II, dễ kớch thớch da và mắt.
Cơ chế gõy độc: Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid (GABA) tại chỗ nối cơ thần kinh của cụn trựng [6].
5.2. Kết quả khảo sỏt về cường độ huỳnh quang của cỏc cảm biến chế tạo từ QD khi nồng độ thuốc trừ sõu thay đổi
5.2.1. Qui trỡnh chung để ghi phổ huỳnh quang của cảm biến đó chế tạo
Nguyờn lý của cảm biến của nghiờn cứu này là đo sự thay đổi của tớn hiệu huỳnh quang, dựa trờn cơ sở phản ứng thủy phõn của ATCh trong mụi trường nước khi cú sự xỳc tỏc của enzyme AChE. Như đó đề cập ở chương 1, hoạt độ đó được xỏc định với mỗi đơn vị của AChE, 1 mol ATCh sẽ bị thủy phõn trong 1 phỳt. Khi cú mặt của thuốc trừ sõu, enzyme AChE sẽ bị ức chế mạnh và phản ứng thủy phõn
ATCh sẽ khụng xảy ra. Từ đú cú thờ̉ xỏc định sự tồn tại của dư lượng bằng cỏch giỏn tiếp, thụng qua sự thay đổi mụi trường xung quanh bề mặt QD và ảnh hưởng tới tớnh chất phỏt xạ huỳnh quang của cỏc QD. Lượng AChE dựng tương ứng với 2 u là 122 àl, cũng được giữ khụng đổi, được gắn lờn QD. Lượng thuốc trừ sõu với cỏc nồng độ khỏc nhau được phõn tỏn trong nước đờ̉ khảo sỏt.
Sau khi gắn enzyme AChE lờn QD, tạo được cấu trỳc QD-SA-AChE, phõn tỏn QD-SA-AChE vào nước với thờ̉ tích đó được tớnh toỏn sao cho thờ̉ tớch tổng của bước cuối là 2 ml. Hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 phỳt. Quỏ trỡnh này tạo điều kiện thớch hợp đờ̉ enzyme hoạt động. Bước tiếp theo, chỳng tụi tạo hỗn hợp ATCh và thuốc trừ sõu với cỏc nồng độ xỏc định. Đờ̉ tiến hành khảo sỏt, hỗn hợp ATCh và thuốc trừ sõu được đổ vào hỗn hợp cảm biếnQD-SA-AChE và ghi phổ huỳnh quang cỏc mẫu ngay sau đú.
Yờu cầu quan trọng trong qui trỡnh chung đờ̉ cảm biến hoạt động hiệu quả là giữ cố định nồng độ QD. Ở đõy chỳng tụi lựa chọn nồng độ 0,3 mol/ml và thờ̉ tớch tổng cộng cuối cựng cho mỗi mẫu là 2 ml. Đõy là nồng độ cơ chất thớch hợp đờ̉ sự hoạt động của lượng enzyme cú hoạt độ 2 u. Nội dung này được trỡnh bày tại mục 1.3.2. Tựy theo thờ̉ tớch của cỏc tỏc nhõn thay đổi mà thờ̉ tích nước thay đổi. Giỏ trị của độ pH khoảng 7,4 khi chưa cú thuốc trừ sõu và ATCh. Dung dịch thuốc trừ sõu phải được đưa vào cảm biến đồng thời cựng với ATCh đờ̉ đảm bảo sự xuất hiện đồng thời của chất gõy ức chế enzyme và chất mà enzyme đặc hiệu xỳc tỏc [114]. Đờ̉ xỏc định nồng độ thuốc trừ sõu thử nghiệm, chỳng tụi theo cỏc tiờu chuẩn nồng độ dư lượng thuốc trừ sõu trờn nụng sản cho phộp đó trỡnh bày ở phần trờn [31], từ 0,01 đến 5 ppm, và một số trường hợp thử nghiệm với nồng độ nhỏ hơn.
Hỡnh 5.2 mụ tả nguyờn lý phỏt hiện thuốc trừ sõu với hai trường hợp: ễ nột đứt trờn (5.2a) mụ tả trường hợp khụng cú thuốc trừ sõu, phản ứng thủy phõn ATCh xảy ra trong mụi trường nước với sự xỳc tỏc của AChE, sinh ra TCh và CH3COOH, làm thay đổi mụi trường chứa QD. Và ụ nột đứt dưới (5.2b) biờ̉u thị sự ức chế của enzyme AchE khi cú sự xuất hiện của thuốc trừ sõu và phản ứng thủy phõn của ATCh khụng xảy ra.
Hỡnh 5.2. Sơ đồ mụ tả nguyờn lý xỏc định thuốc trừ sõu của cảm biến sử dụng QD và AChE
Với cơ chế phỏt hiện này, enzyme AChE xỳc tỏc phản ứng thủy phõn bằng cỏc nhúm hydroxyl tại cỏc tõm hoạt động, tấn cụng vào cỏc nguyờn tử phospho, bắt cỏc điện tử rời khỏi liờn kết O-P, làm cho nguyờn tử phospho hoạt động mạnh lờn, phản ứng diễn ra nhanh hơn. Ngược lại, độc tớnh của thuốc trừ sõu, điờ̉n hỡnh trong đú là parathion methyl, gốc OP và carbosulfan gốc carbamate, là cỏc hợp chất ức chế khụng thuận nghịch enzyme AChE mạnh nhất [6, 49], thụng qua sự hỡnh thành liờn kết đồng hoỏ trị P – O tại nhúm hydroxyl của tõm hoạt động serine của enzyme (hỡnh 5.3) [17, 36, 67].
Hỡnh 5.3. Cơ chế ức chế enzyme AChE bởi parathion metyl (organophosphate) và carbosulfan (carbamate) [33].
Parathion methyl Carbosulfan
(a)
Trờn cơ sở cỏc kết quả phõn tớch cỏc tớnh chất quang ở chương 3, chỳng tụi đó tập trung vào khai thỏc, sử dụng một số loại QD hai thành phần cấu trỳc lừi/vỏ, lừi/đệm/vỏ đó được chế tạo là CdSe/ZnS (10; 14 ML), CdSe/ZnSe 2 ML/ZnS (4,4; 8 ML) và QD ba thành phần CdZnSe/ZnS 6 ML đờ̉ chế tạo cảm biến.
Sự thay đổi độ pH mụi trường đó ảnh hưởng cục bộ đến điện tớch trờn bề mặt cỏc QD [81, 97, 116]. Bờn cạnh đú, sự thay đổi cỏc ligand của QD và sự truyền năng lượng cộng hưởng FRET và BRET từ QD tới phõn tử hữu cơ là chất nhận điện tử và ngược lại đó làm thay đổi tớnh chất phỏt huỳnh quang của tổ hợp chứa QD khi cú sự xuất hiện của thuốc trừ sõu [21, 47, 92].
5.2.2. Huỳnh quang của cảm biến chế tạo từ QD CdSe/ZnS
Đối với loại QD hai thành phần cấu trỳc lừi/vỏ CdSe/ZnS, chỳng tụi đó lựa chọn hai trường hợp với số đơn lớp vỏ ZnS là 10 và 14 ML đờ̉ thớ nghiệm.
Cấu trỳc QD-SA-AChE được chế tạo như trỡnh bày phần trờn. Tiếp sau là tạo hỗn hợp thuốc trừ sõu và ATCh. Chỳng tụi đó tiến hành thực nghiệm với loại cảm biến với QD CdSe/ZnS 10 ML phỏt hiện hai loại thuốc trừ sõu là parathion methyl và acetamiprid với cỏc nồng độ tương ứng là 0,5; 2; 5; 8; 10 (ppm) và 2,5; 4; 5; 8; 10 (ppm).
Hỡnh 5.4a, b biờ̉u diễn phổ huỳnh quang của cảm biến với bước súng kớch thớch 405 nm, phộp ghi phổ được thực hiện ở nhiệt độ phũng. Phõn tích cường độ tớch phõn của cỏc phổ, chỳng tụi thấy cường độ huỳnh quang của cỏc mẫu trờn cú xu hướng tăng lờn (hỡnh 5.4c). Cường độ đỉnh của hỗn hợp QD-MPA mạnh nhất, đõy là mẫu đối chứng. Tuy nhiờn, cường độ huỳnh quang bị giảm mạnh với mẫu QD-AChE-ATCh. Sau đú, với sự tăng lờn của nồng độ thuốc trừ sõu thỡ cường độ huỳnh quang cũng tăng. Giỏ trị cường độ đỉnh phổ huỳnh quang của mẫu QD- AChE-ATCh là nhỏ nhất, và lớn nhất là cường độ huỳnh quang của mẫu QD- MPA. Cỏc giỏ trị cường độ đỉnh trung gian là cỏc trường hợp khi cú sự xuất hiện của thuốc trừ sõu với nồng độ khỏc nhau [89, 90].
Chỳng tụi cũng nhận thấy, biờn độ thay đổi cường độ huỳnh quang của loại cảm biến này là khỏc nhau với hai loại thuốc trừ sõu đó khảo sỏt. Đối với
parathion methyl, so sỏnh hai trường hợp ứng với nồng độ thuốc trừ sõu là 10 và 0,5 ppm, tỉ lệ tăng cường độ huỳnh quang là 3,2 lần (hỡnh 5.4a). Đối với thuốc trừ sõu acetamiprid với nồng độ 10 và 2,5 ppm, tỉ lệ này là 1,4 (hỡnh 5.4b). Mặc dự thang nồng độ hai thuốc trừ sõu chờnh lệch nhau, nhưng vẫn cú thờ̉ thấy được sự tăng cường độ huỳnh quang của trường hợp 5.4a lớn hơn 5.4b. Dựa trờn cơ sở sự ức chế enzyme AChE của thuốc trừ sõu parathion methyl mạnh hơn acetamiprid [6], cho thấy khả năng ức chế enzyme AChE khỏc nhau dẫn đến lượng ATCh bị thủy phõn khỏc nhau, kết quả là sự thay đổi độ pH khỏc nhau và sự tăng cường độ huỳnh quang cũng khỏc nhau.
Hỡnh 5.4. Phổ huỳnh quang của mẫu CdSe/ZnS-AChE với parathion methyl,
nồng độ 0,5; 2; 5; 8; 10 (ppm) (a) và acetamiprid nồng độ 2,5; 4; 5; 8; 10 (ppm). Đường phụ thuộc giữa cường độ huỳnh quang tớch phõn và nồng độ
thuốc trừ sõu parathion methyl và acetamiprid (c).
Cỏc thớ nghiệm tiếp theo được chỳng tụi tiến hành với cảm biến được chế tạo từ loại QD CdSe/ZnS với lớp vỏ ZnS là 14 ML. Thuốc trừ sõu parathion methyl được thực hiện với nồng độ 0,05; 2; 5 và 8 ppb. Phổ huỳnh quang của cỏc mẫu được mụ tả trong hỡnh 5.5a, và đường biờ̉u diễn sự phụ thuộc của cường độ tớch phõn đỉnh phỏt huỳnh quang và nồng độ trờn hỡnh 5.5b.
Parathion methyl Acetamiprid
(a) (b)
Hỡnh 5.5. Phổ huỳnh quang của loạt mẫu QD CdSe/ZnS 14 ML-SA-AChE với nồng độ parathion methyl thay đổi (0.05, 2, 5 and 8 ppb) (a) và sự phụ thuộc cường độ đỉnh và
nồng độ parathion methyl (b).
Phổ huỳnh quang của loại QD CdSe/ZnS 14 ML đó được ghi với bước súng kớch thớch 405 nm, biờ̉u diễn trờn hỡnh 5.5. Loại QD này phỏt huỳnh quang mạnh và ổn định. Đõy chính là nguyờn nhõn chỳng tụi lựa chọn loại QD này đờ̉ chế tạo cảm biến và thớ nghiệm với nồng độ thuốc trừ sõu cỡ ppb. Phõn tớch phổ huỳnh quang chỳng tụi thấy sự thay đổi về cường độ đỉnh huỳnh quang vẫn khỏ rừ rệt, cường độ của huỳnh quang của cảm biến với nồng độ thuốc trừ sõu 8 ppb tăng 16,4 lần so với nồng độ 0,05 ppb. Sự biến thiờn của cường độ khỏ tuyến tớnh với sự tăng của nồng độ thuốc trừ sõu. Kết quả này tương đồng với trường hợp khảo sỏt trờn và đõy là một trong cỏc kết quả đó được chỳng tụi cụng bố [91].
5.2.3. Huỳnh quang của cảm biến chế tạo từ QD CdSe/ZnSe/ZnS
Đõy là loại QD với cấu trỳc lừi/đệm/vỏ với sự ổn định về tớnh chất phỏt quang hơn QD cấu trỳc lừi/vỏ như đó được khảo sỏt ở chương 3. QD CdSe/ZnSe 2 ML/ZnS 4,4 ML với lớp đệm ZnSe 2 ML và lớp vỏ ZnS 4,4 ML cú đỉnh hấp thụ tại bước súng 586 nm (hỡnh 3.3b). Hỡnh 5.6 là phổ huỳnh quang của cỏc cảm biến chế tạo từ QD CdSe/ZnSe2ML/ZnS4ML phỏt hiện thuốc trừ sõu parathion