SỰ THỦY PHÂN PROTEIN BẰNG ENZYME 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nguyen và cộng sự (2011) đã nghiên cứu sự thủy phân nguyên liệu còn lại từ cá ngừ bằng enzyme Protamex và đặc tính sinh hóa của sản phẩm thủy phân. Một chế độ thủy phân đƣợc thực hiện cho các nguyên liệu còn lại từ cá ngừ nhƣ đầu, nội tạng, đuôi ở nhiệt độ 450C, tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu = 1/1, tỷ lệ enzyme 0,1%, pH tự nhiên, thời gian 12h. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, độ thủy phân của đầu, nội tạng và đuôi lần lƣợt là 32,3%, 16,8% và 22,2%. Hiệu suất thu hồi nitơ trong các sản phẩm thủy phân từ đầu, nội tạng và đuôi lần lƣợt là 73,6%, 82,7%, 85,8% [15].
Ovissipour và cộng sự (2010) đã nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares sử dụng enzyme Alcalase và Protamex. Đầu cá ngừ vây vàng thu đƣợc từ quá trình sản xuất cá ngừ đóng hộp đƣợc thủy phân với các thông số sau: nồng độ enzyme sử dụng là 1,5%, pH tự nhiên, tỷ lệ nguyên liệu/nƣớc (w/v) là 1/1. Kết quả cho thấy theo thời gian thủy phân thì độ thủy phân càng cao. Độ thủy phân, hàm lƣợng protein và acid amin
trong sản phẩm thủy phân thu đƣợc khi sử dụng enzyme Alcalase cao hơn so với enzyme Protamex [17].
Sathivel và cộng sự (2005) đã nghiên cứu khi thủy phân đầu cá hồi bằng enzyme Alcalase (0,5%) ở nhiệt độ 500C, trong thời gian 75 phút thì thu đƣợc bột protein thuỷ phân có rất nhiều các thành phần acid amin trong đó hàm lƣợng Isoleucine (3,71g/100g protein), Phenylalanine (4,07g/100g protein), hàm lƣợng Leucine (6,69g/100g protein), và Lysine (7,39g/100g protein). Tổng số acid amin là 98,74 g/100g protein [18].
Motamedzadegan và cộng sự (2010) đã nghiên cứu tối ƣu hóa chế độ thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng Thunnus albacares bằng enzyme Neutrase. Kết quả chỉ ra rằng khi sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng
Thunnus albacares thì các thông số tối ƣu là nồng độ enzyme 37 AU / kg protein,
pH tự nhiên của bản thân nguyên liệu, nhiệt độ từ 50°C, và thời gian 60 phút thì độ thủy phân (DH) đạt 35%, sản phẩm thủy phân có hàm lƣợng protein cao 74,56% và hàm lƣợng lipid thấp 1,86% và đƣợc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và làm thức ăn cho chăn nuôi [14].
Sylla và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc đến quá trình thủy phân protein nguyên liệu còn lại của cá bơn Cynoglossus senegalensis. Quá trình nghiên cứu sự thay đổi tỷ lệ nƣớc đến quá trình thủy phân nguyên liệu còn lại của cá bơn sử dụng enzyme Protamex. Kết quả nghiên cứu đƣợc rằng, sự thay đổi điều kiện thủy phân thì quá trình thủy phân cho tỷ lệ protein nhƣ nhau (60%) nhƣng khác nhau ở cấu tạo của peptide (độ dài peptide từ 294 đến 13700 Da) [19].
Molia (2011) đã sản xuất protein từ nội tạng cá Tầm (Huso Huso) sử dụng enzyme Protamex. Điều kiện tối ƣu cho quá trình thủy phân là 39.210
C, 114.2 phút, nồng độ enzyme là 27.41 AU/kg protein. Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị dinh dƣỡng của dịch thủy phân protein từ nội tạng cá Tầm rất cao [13].
Ovissipour và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase đến thành phần acid amin của dịch thủy phân từ nội
tạng cá Tầm Perian (Acipenser persicus). Quá trình thủy phân protein nội tạng cá Tầm Perian, đƣợc thực hiện ở nhiệt độ 550C, thời gian 205 phút, pH=8,5, tỷ lệ enzyme Alcalase 2,4L/nguyên liệu (E/S) là 0,1 AU/g protein. Hàm lƣợng protein của sản phẩm thủy phân thu đƣợc là 65,82%, hàm lƣợng lipid là 0,18%. Độ thủy phân thu đƣợc cao nhất đƣợc thực hiện ở 550
C, sau 205 phút (46,13%). Kết quả cho thấy hàm lƣợng acid amin thủy phân từ nội tạng cá nhìn chung cao hơn hàm lƣợng acid amin so với tiêu chuẩn của FAO/WHO cho ngƣời lớn [16].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Lâm Tuyết Hận (2009) đã nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá chẽm có điều kiện hoạt động là pHopt = 7,5 – 8, topt = 350C, muối ăn ở nồng độ càng cao thì hoạt độ enzyme càng giảm. Từ đây đã sử dụng enzyme đƣợc thu nhận này ứng dụng vào nghiên cứu thủy phân cá nục thuôn và thu đƣợc kết quả về các thông số ảnh hƣởng đến sự thủy phân: pH = 8, tỉ lệ nƣớc 20%, NaCl = 2%, E/S = 2%, t = 500C, T = 14 giờ. Kết quả thu đƣợc bột đạm cá nục thuôn có hàm lƣợng protein thô là 79,93%, protein hòa tan 13,45%, Naa = 16,65%, bột đạm hòa tan là 89,65%, bộ đạm không hòa tan là 10,35% [2].
Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng (2011) đã nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng và sử dụng sản phẩm thủy phân này trong thức ăn cho tôm. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, việc bổ sung bột protein thủy phân từ đầu cá ngừ vào trong thức ăn cho tôm đã cải thiện sự tăng khối lƣợng của tôm, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng protein [5], [6].
Nguyễn Thị Ngọc Hoài (2012) đã nghiên cứu thu hồi và đặc trƣng hóa tính chất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme. Kết quả dịch thủy phân protein thu đƣợc đem cô quay ở nhiệt độ 450
C, áp suất hút chân không là 50mbar, thời gian hút là 20 phút, nồng độ chất khô trong dịch thủy phân sau cô quay là 22o Brix. Sau đó, tiến hành sấy phun dịch cô quay ở nhiệt độ 130o
C, nồng độ maltodextrin bổ sung là 8%, mẫu thu đƣợc có độ ẩm là 10% , trong 1 gam bột thì hàm lƣợng protein hòa tan là 110,1mg [4].
Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự (2011) đã nghiên cứu sử dụng enzyme protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra và ứng dụng sản phẩm thủy phân trong việc sản xuất nƣớc mắm. Điều kiện tối ƣu cho việc thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis nhƣ sau: nhiệt độ 500C, pH = 7,6; tỷ lệ nƣớc 30%, nồng độ muối 2%, hoạt độ enzyme 50UI và thời gian thủy phân là 18 giờ. Sản phẩm nƣớc mắm thu đƣợc sau khi ủ ở tỷ lệ bã chƣợp 20% có hàm lƣợng đạm formol 14,5 g/l, đạm tổng số 16 g/l, đạm NH3 1,49 g/l và acid amin 12,81 g/l [9].
PHẦN 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu đầu xƣơng cá Tra
Hình 2.1.Đầu xương cá Tra
Nguyên liệu đầu xƣơng cá Tra Pangasius hypophthalmus đƣợc cung cấp bởi công ty cổ phần Nam Việt, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang. Nguyên liệu đƣợc cấp đông, sau đó đƣợc vận chuyển từ An Giang ra Nha Trang, rồi đƣợc đƣa đến phòng thí nghiệm Công nghệ Chế Biến, trƣờng Đại học Nha Trang. Tại đây, nguyên liệu đƣợc rã đông, xay nhỏ, nguyên liệu sau khi xay đƣợc đồng nhất và đƣợc đóng trong các túi nhỏ, khối lƣợng là 100g và 500g. Sau khi đóng gói xong, nguyên liệu đƣợc bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -200C cho đến khi sử dụng.
2.1.2. Enzyme Alcalase và Flavourzyme
2.1.2.1.Enzyme Alcalase
Enzyme Alcalase của hãng Novozyme, Đan Mạch. Enzyme Alcalase thu đƣợc
từ Bacillus licheniformis. Đây là protease đƣợc phân tách và tinh sạch từ nguồn vi
sinh vật. Alcalase là 1 endo-protease. Điều kiện hoạt động tối ƣu cho enzyme Alcalase, pH từ 6,5 ÷ 8,5 , nhiệt độ 45 ÷ 650C. Enzyme này bị bất hoạt ở 85oC trong 10 phút. Nhiệt độ bảo quản enzyme Alcalase là từ 3 ÷ 50C.
2.1.2.2.Enzyme Flavourzyme
Enzyme Flavourzyme của hãng Novozyme, Đan Mạch. Chế phẩm enzyme Flavourzyme đƣợc chiết xuất từ nấm Aspergillus oryzae. Chế phẩm là hỗn hợp của chủng Bacillus, Flavourzyme có cả hoạt tính của endoprotease và exoprotease, có nhiệt độ hoạt động thích hợp ở 50 ÷ 550C, pH hoạt động nằm trong khoảng 5,0 ÷ 7,0, enzyme này bị bất hoạt ở 85oC trong 10 phút hoặc 1200C trong vòng 5 giây. Tuy nhiên, sự khử hoạt tính của Flavourzyme phụ thuộc nhiều vào cơ chất, điều kiện môi trƣờng hoạt động (nồng độ cơ chất, pH …). Nhiệt độ bảo quản thích hợp cho enzyme này từ 0 ÷ 100C.
Chế phẩm này của hãng Novozymes sản xuất và đã đƣợc tổ chức FAO cho phép sử dụng trong thực phẩm.
2.2. SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.2.1. Xác định thành phần hóa học của đầu xƣơng cá Tra
Thành phần hóa học của đầu xƣơng cá Tra đƣợc xác định theo sơ đồ hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ xác định thành phần hóa học của đầu xương cá Tra
Nghiền nhỏ
Xác định thành phần: nƣớc, lipid, protein, khoáng
Kết quả Đầu xƣơng cá Tra
2.2.2. Quy trình dự kiến sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu xƣơng cá Tra cá Tra
Hình 2.3.Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất sản phẩm thủy phân đầu xương cá Tra
Thuyết minh sơ đồ quy trình:
* Nguyên liệu Lipid - Tỷ lệ N/NL - Tỷ lệ E/NL - Nhiệt độ TP - Thời gian TP - pH tự nhiên
Đầu xƣơng cá Tra
Thủy phân bằng Alcalase Xử lý Nghiền nhỏ - Tỷ lệ E/NL - Nhiệt độ TP - Thời gian TP - pH tự nhiên Bã ly tâm Thủy phân bằng Flavourzyme
Sấy phun Lọc
Dịch thủy phân
Bột thủy phân protein Bã lọc
Ly tâm Bất hoạt enzyme
Đầu xƣơng cá Tra có chất lƣợng tốt, màu sắc tự nhiên, mùi tự nhiên, không có dấu hiệu bị ƣơn.
* Xử lý
Nguyên liệu đƣợc cấp đông, tiến hành rã đông, sau đó chặt nhỏ để thuận lợi cho công đoạn tiếp theo.
* Nghiền nhỏ
Nguyên liệu sau khi đã rã đông và xử lý xong, đem nghiền nhỏ với đƣờng kính lỗ sàng là 3mm, nhằm tăng diện tích tiếp xúc, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn. Sau đó cho nguyên liệu vào trong các túi nhựa để tiện cho quá trình thủy phân sau này.
* Thủy phân bằng enzyme Alcalase
Nguyên liệu đƣợc đem thủy phân với enzyme Alcalase với tỷ nƣớc/nguyên liệu là 1/1, khuấy trộn đều, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân nhất định. Tiến hành khuấy đảo thƣờng xuyên tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn. Sau khi thủy phân tiến hành bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút.
* Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme
Nguyên liệu đƣợc đem thủy phân tiếp tục bằng enzyme Flavourzyme với tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân nhất định. Tiến hành khuấy đảo thƣờng xuyên tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn.
* Bất hoạt enzyme
Sau khi thủy phân tiến hành bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. * Lọc
Sau khi thủy phân, bất hoạt enzyme, tiến hành lọc. Lọc xong ta loại bỏ đƣợc phần bã lọc (chủ yếu là xƣơng).
* Ly tâm
Sau khi lọc xong, ly tâm trong thời gian 30 phút với tốc độ ly tâm là 5000 vòng/phút. Ly tâm xong ta thu đƣợc dịch thủy phân protein, lipid và bã ly tâm.
Dịch thủy phân sau khi phối trộn Maltodextrin 10%, đƣợc đem đi sấy phun ở nhiệt độ 1350C, tốc độ bơm dịch 12ml/phút, áp suất khí nén = 0,5bar.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu xƣơng cá Tra phân đầu xƣơng cá Tra
2.2.3.1.Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy
phân ở giai đoạn đầu
1. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp
Bã lọc
Chọn tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp Thủy phân bằng enzyme Alcalase (N/NL= 1/1,
t=500C, pH tự nhiên, τ =2 giờ) Rã đông Mẫu 1 (0,1%) Mẫu 3 (0,5%) Mẫu 5 (0,9%) Mẫu 2 (0,3%) Rã đông Thủy phân (t= 500C, τ = 4 giờ , N/NL = 1/1, pH tự nhiên) Mẫu 1 (0.1%) Mẫu 2 (0.3%) Mẫu 3 (0.5%) Mẫu 2 (0.3%) Mẫu 4 (0,7%) Nguyên liệu
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL=0,3%, t=500C, pH tự nhiên, τ =2 giờ)
Bất hoạt enzyme
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Naa, NNH3 Dịch thủy phân
Ly tâm Bã ly tâm
Tiến hành thủy phân 5 mẫu đầu xƣơng cá Tra, mỗi mẫu 100g nguyên liệu với tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu là: 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7% và 0,9%. Thủy phân ở các thông số cố định: tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu là 1/1, nhiệt độ thủy phân là 500C, pH tự nhiên của cá, thời gian thủy phân là 2 giờ. Sau khi thủy phân xong, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút. Sau đó để nguội xuống 500C rồi tiếp tục thủy phân với enzyme Flavourzyme, với thông số cố định nhƣ sau: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu là 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, pH tự nhiên, thời gian thủy phân 2 giờ. Sau khi thủy phân xong làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút. Để nguội rồi đem hỗn hợp ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, sau đó tách riêng 3 phần: dịch thủy phân, lipid và bã ly tâm. Dịch thủy phân đƣợc đem đi xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac. Từ đó chọn tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp.
2. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân ở giai đoạn đầu thích hợp
nh 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân giai đoạn đầu thích hợp
Chọn nhiệt độ thủy phân giai đoạn đầu thích hợp
Bã lọc Thủy phân bằng enzyme Alcalase (N/NL= 1/1, E/Nl
thích hợp, pH tự nhiên, τ =2 giờ) Rã đông Mẫu 1 400C Mẫu 3 500C Mẫu 5 600C Mẫu 2 450C Mẫu 4 550C Nguyên liệu
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL=0,3%, t=500C, pH tự nhiên, τ =2 giờ)
Bất boạt enzyme
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Naa, NNH3 Dịch thủy phân
Ly tâm Bã ly tâm
Tiến hành thủy phân 5 mẫu đầu xƣơng cá Tra, mỗi mẫu 100g nguyên liệu với 5 nhiệt độ thủy phân khác nhau: 400C, 450C, 500C, 550C, 600C. Thủy phân với các thông số cố định: tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu là 1/1, tỷ lệ enzyme Alcalase thích hợp đã xác định ở thí nghiệm trƣớc, pH tự nhiên của cá, thời gian thủy phân là 2 giờ. Sau khi thủy phân xong làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút. Sau đó để nguội xuống 500
C rồi tiếp tục thủy phân với enzyme Flavourzyme, với thông số cố định nhƣ sau: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu là 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, pH tự nhiên, thời gian thủy phân 2 giờ. Sau khi thủy phân xong, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút. Để nguội rồi đem hỗn hợp ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, sau đó tách riêng 3 phần: dịch thủy phân, lipid và bã ly tâm. Dịch thủy phân đƣợc đem đi xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac. Từ đó chọn tỷ lệ nhiệt độ thủy phân giai đoạn đầu thích hợp.
3. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân giai đoạn đầu thích hợp
Hình 2.6.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân giai đoạn đầu thích hợp
Mẫu 3 3 giờ
Bã lọc
Chọn thời gian thủy phân giai đoạn đầu thích hợp Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL=0,3%,
t=500C, pH tự nhiên, τ =2 giờ)
Bất hoạt enzyme
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Naa, NNH3 Dịch thủy phân Ly tâm Bã ly tâm Lipid Mẫu 1 1 giờ Mẫu 6 6 giờ Mẫu 2 2 giờ Mẫu 4 4 giờ Mẫu 5 5 giờ Thủy phân bằng enzyme Alcalase (N/NL= 1/1, E/NL,
nhiệt độ thích hợp, pH tự nhiên, τ =2 giờ) Rã đông
Tiến hành thủy phân 6 mẫu đầu xƣơng cá Tra, mỗi mẫu 100g nguyên liệu với 6 thời gian thủy phân khác nhau: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ. Thủy phân với các thông số cố định: tỷ lệ nƣớc/nguyên liệu là 1/1, tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu và nhiệt độ thủy phân thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trƣớc, pH tự nhiên của cá. Sau khi thủy phân xong, bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900
C trong 15 phút. Sau đó để nguội xuống 500C rồi tiếp tục thủy phân với enzyme