Hạt từ chitosan được bọc bằng chitosan biến tính (xem chương 3, mục) nên có chứa cả nhóm carboxyl và nhóm amin. Chính vì thế chúng tôi đã thực hiện phản ứng tạo phức giữa hạt từ chitosan (MPCS) với protein (BSA, kháng thể đơn dòng) có sử dụng chất nối EDC (nối nhóm carboxyl với nhóm amin) hoặc BS3 (nối nhóm amin với nhóm amin).
Quy trình tạo phức hợp hạt từ chitosan với protein có sử dụng chất nối EDC
Quy trình tạo phức hợp hạt từ chitosan với protein có sử dụng chất nối EDC tương tự quy trình tạo phức hợp hạt từ Dynabeads với protein (xem mục
2.2.2.1). Trong đó, khối lượng hạt từ chitosan và BSA cho mỗi phản ứng tương ứng là 500µg hạt từ chitosan và 100µg BSA. Để tối ưu hóa lượng protein phản ứng với hạt từ chitosan, chúng tôi cho 500µg hạt từ chitosan phản ứng với lần lượt 10µg, 20µg, 40µg và 80µg BSA có sử dụng chất nối EDC theo quy trình như trên. Phức hợp tạo thành được phân tích bằng phương pháp FESEM.
Quy trình phản ứng tạo phức hợp hạt từ chitosan với protein có sử dụng chất nối BS3
Bước 1: Gắn BS3 với nhóm amin của hạt từ chitosan
1. Lấy 500µg hạt từ chitosan vào ống nghiệm, loại bỏ dịch tan 2. Rửa hạt từ chitosan 4 lần bằng 100µl dung dịch PBS 1x
3. Phân tán hạt từ chitosan vào 100µl BS3 3mg/ml trong PBS, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc tròn với tốc độ 200 vòng/phút
4. Dùng nam châm thu lại hạt từ chitosan đã gắn với chất nối BS3, bỏ dịch tan có chứa BS3 dư
5. Rửa hạt từ chitosan đã gắn với chất nối BS3 4 lần bằng100 µl PBS 1x
Bước 2: Gắn hạt từchitosan đã kích hoạt với protein 6. Phân tán hạt từvào 75µl H2O + 20µl PBS 5x
7. Thêm 100µg BSA, dùng pipet trộn nhẹ, ủ 2giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc tròn với tốc độ 200 vòng/phút
8. Thu lại phức hợp hạt từ chitosan với BSA (MPCS-BS3-BSA) và dịch tan của nó.
9. Rửa MPCS-BS3-BSA 3 lần bằng 100µl PBS-T
Các phức hợp tạo thành được phân tích bằng phương pháp FTIR và FESEM (xem mục 2.2.3). Mẫu đối chứng (hạt từ chitosan hòa trộn với BSA không sử dụng chất nối) được thực hiện tương tự như quy trình ở trên, nhưng không bổ sung chất nối EDC hay BS3.