Hạt từ chitosan là hạt từ (Fe3O4) được bọc lớp chitosan biến tính, kích thước trung bình 20nm được Viện Khoa học Vật liệu cung cấp. Chitosan biến tính có cấu trúc tương tự chitosan, nhưng nhóm hydroxyl ở vị trí C6’được thay thế bởi một nhóm carboxylic (Hình 3.7). Chitosan biến tính là một polymer hữu cơ ưa nước, mỗi monomer đều có nhóm hydroxyl (–OH), nhóm amin (– NH2) và nhóm carboxyl (–COOH), do đó nó có khảnăng tương thích sinh học [Zhu 2005 a b].
Hình 3.7. Sự hình thành của chitosan và chitosan biến tính trong nước Vì hạt từ được bọc chitosan biến tính (sau đây viết tắt là hạt từ chitosan) nên trên bề mặt của chúng có các nhóm chức nhóm carboxyl, nhóm amin. Protein là một phân tử cũng có cả nhóm carboxyl và nhóm amin. Vì vậy protein được gắn với hạt từ chitosan bằng 2 chất nối:
(1) 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC) nối nhóm –COOH của hạt từ với protein (kí hiệu là P) (Hình 3.8 a).
(2) bis[sulfosuccinimidyl] suberate (BS3) nối amin của hạt từ với nhóm amin của protein (Hình 3.8 b).
Hình 3.8. Mô hình hạt nano từ bọc chitosan biến tính sử dụng chất nối để tạo phức hợp với protein
6’ 6’
6’ 6’
Chitosan biến tính
Tương tự như đối với hạt từ Dynabeads, để tạo liên kết giữa nhóm carboxyl trên hạt từ chitosan với nhóm amin của protein chúng tôi đã sử dụng chất nối (EDC) trong môi trường MES pH 5,5.
Chất nối BS3 được sử dụng để tạo liên kết giữa nhóm amin trên hạt từ chitosan và nhóm amin của protein trong môi trường PBS pH 7,4. BS3 có hai nhóm N-Hydroxysuccinimide –ester (NHS-ester) như nhau ở hai đầu phân tử dễ dàng phản ứng với nhóm amin. Để tránh trường hợp BS3 còn dư sẽ gắn kết các protein lại với nhau chúng tôi đã thực hiện phản ứng theo hai bước.
o Bước 1: Tạo phức hợp hạt từ chitosan với chất nối bằng cách cho BS3 phản ứng với hạt từ chitosan trong môi trường PBS pH 7,4 (Hình 3.9a). Sau đó tinh sạch hạt từ chitosan – chất nối bằng cách dùng nam châm giữ lại hạt từ và loại bỏ dịch tan chứa BS3 dư.
o Bước 2: Bổ sung protein (BSA hoặc kháng thể đơn dòng) vào dung dịch hạt từ chitosan–chất nối để tạo phức hợp hạt từ chitosan với protein (Hình 3.9 b).
Phức hợp hạt từ chitosan–protein sau khi được tạo thành đã được phân tích bằng phương pháp phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR) và phương pháp kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM).
Hình 3.9.Cơ chế gắn protein lên hạt từ chitosan sử dụng chất nối BS3 So sánh phổ FTIR của hạt từ chitosan trước và sau khi gắn với protein. Trên phổ FTIR của hạt từ chitosan (Hình 3.10 a) có đỉnh hấp thụ tại tần số 559 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết hóa trị Fe–O của sắt từ. Đỉnh hấp thụ tại tần số 2924 cm-1đặc trưng cho dao động của liên kết C–H trong –CH2. Đỉnh hấp thụ tại tần số 3410 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết O–H trong
a
–COOH. Đỉnh hấp thụ tại tần số 1620 cm-1đặc trưng cho dao động của liên kết C=O của COO–.
Hình 3.10. Phổ FTIR của hạt từ chitosan (a) và hạt từ chitosan gắn BSA sử dụng chất nối EDC (b)
Hình 3.11. Phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn BSA khi sử dụng chất nối BS3(a) và khi không sử dụng chất gắn hay chất nối (b)
Trên phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn với protein sử dụng chất nối EDC (Hình 3.10 b) đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong COO– (1620 cm-1) dịch chuyển về đỉnh hấp thụ đặc trưng của liên kết C=O trong amide (1631 cm-1). Chứng tỏ rằng nhóm amin của protein đã phản ứng với nhóm carboxyl trên hạt từ để tạo liên kết amide.
Trên phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn protein có sử dụng chất nối BS3 (Hình 3.11 a) đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong COO– (1620 cm-1) dịch chuyển về đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong amide (1624 cm-1). Chứng tỏ rằng nhóm amin của protein đã phản ứng với nhóm amin trên hạt từ chitosan tạo thành liên kết amide.
Để đối chiếu, hạt từ chitosan và protein được ủ ở điều kiện tương tự như hai trường hợp trên nhưng không sử dụng chất nối. Phổ FTIR của phức hợp này (Hình 3.11 b) không có bất kì sự khác biệt nào về các đỉnh hay dải hấp thụ so với phổ FTIR của hạt từ chitosan ban đầu (Hình 3.10 a). Điều này chứng tỏ rằng, phải có mặt chất nối EDC hoặc BS3 thì mới xảy ra phản ứng hóa học tạo phức hợp giữa hạt từ chitosan và protein.
Như vậy, bằng phương pháp phân tích phổFTIR chúng tôi đã chứng minh được rằng phức hợp hạt từ chitosan–BSA đã được tạo thành công có sử dụng chất gắn EDC hoặc chất nối BS3.
a b
e
Hình 3.12. Ảnh FESEM của hạt từ chitosan gắn BSA với các tỉ lệ khối lượng khác nhau. Hạt từ chitosan:BSA (w/w): (b) 50:1; (c) 25:1; (d) 25:2. (e) 25:4. (a)
Hạt từ chitosan
Chúng tôi đã tối ưu hóa lượng protein phản ứng với hạt từ chitosan bằng cách cho 500µg hạt từ chitosan phản ứng lần lượt với 10µg protein, 20µg protein, 40µg protein và 80µg protein và quan sát sản phẩm bằng FESEM. Kết quả phân tích cho thấy, với lượng hạt từ chitosan cố định, khi tăng dần lượng protein thì độ phân tách giữa các hạt ngày càng rõ rệt hơn và đến khi tỉ lệ hạt từ chitosan và protein là 25:4 thì độ phân tách giữa các hạt chững lại. Điều đó chứng tỏprotein đã được gắn trên hạt từ chitosan, làm cho hạt từchitosan được bao bọc thêm một lớp polymer hữu cơ nữa, do đó các hạt từ phân tách nhau. Từ kết quả trên chúng tôi đã lựa chọn tỉ lệ hạt từ chitosan là 25:5, tức là tỉ lệ hạt từ chitosan và protein là 5:1 để đảm bảo chắc chắn rằng hạt từ chitosan đã phản ứng hoàn toàn với protein, tức là đã đạt tới tỉ lệ bão hòa. Tỉ lệ này được chúng tôi sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.