3.3.1. Biến đổi bề mặt chấm lượng tử
Chấm lượng tử lõi vỏ CdSe/ZnSe/ZnS (quantum dots – QDs) do Viện Khoa học Vật Liệu cung cấp, được bọc bởi một số chất hữu cơ như TOP, TOPO hay HDA (Hình 3.13) giúp chấm lượng tử ổn định trong dung môi, ngăn chặn sự kết thành đám.
Hình 1.13. Mô hình cấu trúc của các phân tử TOP (A), TOPO(B), HDA (C). Để chấm lượng tử có khả năng ứng dụng trong y–sinh, cần phải biến đổi bề mặt chấm lượng tử để đạt được hai mục tiêu.
o Thứ nhất, chấm lượng tử sau khi biến đổi bề mặt phải tan tốt trong nước vì phần lớn các phản ứng sinh học đều diễn ra trong dung môi là nước.
o Thứ hai, bề mặt chấm lượng tử phải có các nhóm chức hữu cơ có thể gắn kết được với các nhóm chức hữu cơ trên các phần tử sinh học.
Phần lớn các phần tử sinh học đều có gốc carboxyl (–COOH) hoặc gốc amin (–NH2) hoặc cả hai gốc này. Trong điều kiện phù hợp các nhóm carboxyl có khả năng phản ứng với các nhóm amin, hoặc cũng có thể nối hai nhóm amin lại với nhau thông qua chất nối. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành carboxyl hóa và amin hóa bề mặt chấm lượng tử để trên bề mặt chấm lượng tử cho nhóm chức carboxyl hoặc nhóm chức amin tương thích với các phân tử sinh học.
Phản ứng biến đổi bề mặt chấm lượng tử với nhóm carboxyl hay nhóm amin được thực hiện bởi phản ứng trao đổi ligand (Hình 3.14). Phản ứng trao đổi ligand là phản ứng thay thế các phân tử hữu cơ này bằng phân tử hữu cơ có ái lực mạnh hơn với bề mặt giá thể. Chấm lượng tử được chế tạo bằng phương pháp nhiệt phân các tiền chất cơ kim ở nhiệt độ cao trong môi trường hữu cơ TOP, TOPO và HDA, do đó các phân tử hữu cơ này bám lên bề mặt chấm lượng tử trong quá trình chế tạo. TOP, TOPO và HDA là các phân tử hữu cơ không phân cực chỉ tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như toluene, chloroform, hexane… nên chấm lượng tử ban đầu tan trong các dung môi không phân cực.
Hình 3.14. Phản ứng trao đổi ligand biến đổi bề mặt chấm lượng tử
Để chức năng hóa bề mặt chấm lượng tử chúng tôi chọn các hợp chất có nhóm thiol (nhóm –SH) như Mercaptopropionic acid (MPA) và 2-aminoethanethiol (AET) vì nhóm thiol có ái lực với vỏ ZnS của chấm lượng tử mạnh hơn so với các phân tử hữu cơ như TOP, TOPO và HDA. Các hợp chất có nhóm thiol này sẽ thay thế các phân tử hữu cơ trên bề mặt chấm lượng tử bằng cách trao đổi ligand.
Carboxyl hóa bề mặt chấm lượng tử
Carboxyl hóa bề mặt chấm lượng tử là quá trình tạo thành các nhóm carboxyl (–COOH) trên bề mặt chấm lượng tử. Để carboxyl hóa bề mặt chấm lượng tử chúng tôi sử dụng MPA. MPA là phân tử hữu cơ, một đầu có nhóm thiol sẽ thực hiện phản ứng trao đổi ligand với các chấm lượng tử, đầu còn lại có nhóm carboxyl có khả năng liên kết với protein. MPA được hòa tan trong chloroform trong môi trường bazơ. Do vậy, khi chuẩn bị dung dịch MPA trong chloroform chúng tôi thêm vào chất bazơ là TMAH, ủ lắc mạnh trong 1 giờ. Để phản ứng trao đổi ligand đạt hiệu quả cao chúng tôi đã tiến hành ủ chấm lượng tử với dung dịch MPA trong 6 ngày, sau đó kiểm tra khả năng phân tán trong dung môi là nước.
Chấm lượng tử ban đầu được bọc bởi các phân tử kỵ nước như TOP, TOPO và HDA nên chúng tan trong dung môi hữu cơ chloroform mà không tan trong nước (Hình 3.15 a). Sau khi chấm lượng tử được ủ với dung dịch MPA trong chloroform, bề mặt kỵ nước của chấm lượng tử được thay thế bởi MPA trở thành các chấm lượng tử có các nhóm carboxyl trên bề mặt. Do đó, sau phản
ứng các chấm lượng kết tủa trong chloroform. Khi cho thêm nước vào hỗn hợp sau phản ứng thì kết tủa này phân tán pha nước và tan trong nước (Hình 3.15 b). Như vậy, sau phản ứng trao đổi ligand với MPA, bề mặt các chấm lượng tử đã được carboxyl hóa và các chấm lượng tử tan tốt trong nước. Chấm lượng tử được carboxyl hóa bề mặt được ký hiệu là QDs–COOH.
Hình 3.15. Ảnh huỳnh quang của chấm lưởng tử dưới đèn UV trước (a) và sau (b) khi biến đổi bề mặt với MPA
Để kiểm tra sự phụ thuộc vềđộ tan của QD–COOH vào pH, chúng tôi đã hòa tan QD–COOH lần lượt vào trong các môi trường MES pH 5,5, H2O pH 7,0 và borate pH 8,6. Kết quả thí nghiệm cho thấy, QD–COOH phân tán trong borate tốt hơn trong nước, trong nước tốt hơn trong MES. Trên bề mặt QD–COOH là các nhóm carboxyl nên ở pH 8,6 của đệm borate nhóm COOH chuyển thành muối COO– nên chấm lượng tử phân tán trong borate tốt hơn trong nước và trong MES. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn borate để hòa tan QD–COOH cho các thí nghiệm tiếp theo. Mẫu QD–COOH trong borate sau một tháng vẫn phân tán và phát quang tốt.
Amin hóa bề mặt chấm lượng tử
Để amin hóa bề mặt chấm lượng tử chúng tôi sử dụng AET. AET là hợp chất hữu cơ, một đầu là nhóm –SH, đầu kia là nhóm amin (–NH2). Ban đầu chấm lượng tử tan trong dung môi hữu cơ chloroform mà không tan trong nước do được bọc bởi các phân tử kỵ nước TOP, TOPO và HDA (Hình 3.16 a). Sau khi cho AET phản ứng với dung dịch chấm lượng tử trong chloroform thì bề mặt kỵ nước (TOP/TOPO/HDA) của chấm lượng tử dần được thay thế bởi AET và trở thành QD có các nhóm amino trên bề mặt. Vì vậy sau phản ứng QD kết tủa trong chloroform và methanol. Khi cho thêm nước vào hỗn hợp sau phản ứng thì kết tủa này tan trong nước (Hình 3.16 b). Như vậy, sau
Pha nước Pha chloroform
phản ứng trao đổi ligand bề mặt QD được amin hóa và QD phân tán tốt trong nước. Chấm lượng tử được amin hóa bề mặt được ký hiệu là QD–NH2.
Hình 3.16. Ảnh huỳnh quang của chấm lưởng tử dưới đèn UV trước (a) và sau (b) khi biến đổi bề mặt với AET
Vì sử dụng MPA hoặc AET dư, nên sau khi biến đổi bề mặt chấm lượng tử, trong dung dịch vẫn còn MPA hoặc AET. Hai chất này có nhóm carboxyl hoặc amin nên có thể cạnh tranh với các chấm lượng tử để phản ứng với protein khi có mặt chất nối. Do đó chấm lượng tử sau khi biến đổi bề mặt đã được tinh sạch khỏi MPA và AET dư bằng phương pháp tủa trong methanol.
Chấm lượng tử trước và sau khi biến đổi bề mặt bằng MPA hoặc AET được phân tích bằng phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR).
Hình 3.17. Phổ FTIR của chấm lượng tửtrước khi biến đổi bề mặt N–H
Trên phổ FTIR của QD (Hình 3.17) có đỉnh hấp thụ tại tần số 1053 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết P=O và đỉnh hấp thụ tại tần số 1377 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết P–C trong phân tử TOP/TOPO sau khi liên kết với QD. Đỉnh hấp thụ tại tần số 1616 cm-1đặc trưng cho dao động của liên kết N–H trong phân tử HDA. Ngoài ra, trên phổ còn xuất hiện thêm các đỉnh hấp thụ tại tần số 2920 cm-1 (liên kết C–H) và 2854 cm-1 (liên kết C–O). Như vậy, trên bề mặt chấm lượng tử có cả ba phân tử TOP/TOPO và HDA.
a
b Hình 3.18. Hình ảnh phổ FTIR của chấm lượng tửđã biến đổi bề mặt
với MPA (a) và AET (b) QD–COOH
Trên phổ FTIR của QD–COOH (Hình 3.18 a) xuất hiện thêm các đỉnh hấp thụ tại tần số 624 cm -1 đặc trưng cho dao động của liên kết C–S giữa phân tử MPA với QD, đỉnh hấp thụ tại tần số 1558 cm-1đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong –COO– và đỉnh hấp thụ tại tần số 1697 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O trong –COOH. Như vậy, TOP, TOPO và HDA trên bề mặt của QD đã được thay thế bằng MPA với nhóm carboxyl.
Trên phổ FTIR của QD–NH2 (Hình 3.18 b) xuất hiện thêm các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C–S của phân tử AET (605 cm-1) và đỉnh hấp thụ đặc trưng cho liên kết N–H của nhóm chức amin (–NH2) trong phân tử AET (1600 cm-1). Chứng tỏ rằng các phân tử AET đã thay thế các phân tử TOP, TOPO và HDA trên bề mặt QD.
Như vậy chấm lượng tử lõi vỏ CdSe/ZnSe/ZnS đã được biến đổi bề mặt bằng MPA hoặc AET để có nhóm carboxyl hoặc nhóm amin trên bề mặt. Chấm lượng tử sau biến đổi bề mặt được phân tích bằng phướng pháp FTIR. QD–NH2 tan rất tốt trong nước. QD–COOH tan trong dung dịch đêm borate với pH 8,6 tốt hơn so với trong nước và dung dịch đêm MES với pH 5,5.
3.3.2. Phức hợp chấm lượng tử-protein (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chấm lượng tử có nhóm carboxyl (QD–COOH)
Để gắn protein với QD–COOH, chúng tôi sử dụng EDC làm chất nối. Quy trình thực hiện phản ứng được tiến hành theo hai bước như mục 3.1. để tránh EDC làm các protein liên kết lại với nhau.
Chấm lượng tử có nhóm amin (QD–NH2)
Để gắn protein với QD–NH2, chúng tôi sử dụng BS3 làm chất nối. Hai nhóm N-Hydroxysuccinimide–ester (NHS-ester) như nhau ởhai đầu phân tử của BS3 có khả năng phản ứng với nhóm amin trên chấm lượng tử và nhóm amin của protein. Để tránh BS3 nối hai nhóm amin của phân tử protein với nhau, chúng tôi đã thực hiện phản ứng theo hai bước.
o Bước 1: BS3 phản ứng với nhóm amin trên bề mặt QD–NH2 tạo ra phức hợp QD–chất nối (Hình 3.19). Hỗn hợp dung dịch được li tâm để giữ lại kết tủa QD–chất nối và loại bỏ dịch tan chứa BS3 dư.
o Bước 2: Tạo phức hợp chấm lượng tử với protein. Kết quả là protein được liên kết với chấm lượng tử thông qua cầu nối trung gian tạo thành phức hợp QD–BS3–kháng thể (Hình 3.20).
Hình 3.19.Sơ đồ phản ứng NHS-ester với chấm lượng tử
Hình 3.20. Sơ đồ phản ứng gắn protein lên QD–NH2 bằng BS3
Kết quả tạo phức hợp chấm lượng tử–BSA được phân tích bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) và phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide.
QD–NH2 trước khi tạo phức hợp với protein là các hạt có kích thước từ 100nm đến 400nm (Hình 3.21 a). Sau khi QD–NH2 tạo phức hợp với protein, các hạt bị phân tách thành các hạt nhỏ có kích thước khá đồng đều, khoảng 10nm (Hình 3.21 b). Sự khác biệt này cho thấy, protein đã tương tác với chấm lượng tử, hình thành thêm lớp chất hữu cơ trên bề mặt làm các chấm lượng tử phân tách nhau tốt hơn.
Hình 3.21.Ảnh FESEM của QD–NH2trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp với kháng thểđơn dòng QDs_chất nối QD–chất nối BS3 QD–NH2 QD–chất nối Protein Protein–QD a b
Kết quả chụp FESEM chấm lượng tử có nhóm carboxyl (QDs–COOH) trước khi tạo phức hợp với protein cho thấy các chấm lượng tử này bị kết tụ lại với nhau thành các cụm hạt (Hình 3.22 a). Sau khi QD–COOH được tạo phức hợp với protein thì các cụm hạt đã phân tách thành các hạt rời rạc phân tách nhau, kích thước của hạt rất đồng đều (khoảng 10nm-20nm) (Hình 3.22 b). Điều này chứng tỏ các protein đã phản ứng với QD–COOH tạo thành phức hợp chấm lượng tử–protein.
Hình 3.22. Ảnh FESEM của QD–COOH trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp với kháng thểđơn dòng
Chúng tôi đã tối ưu lượng protein phản ứng với chấm lượng tử bằng cách cho 100µg QD–NH2 phản ứng lần lượt với 2µg, 5µg và 10µg BSA và đánh giá sản phẩm bằng phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (Hình 3.23). Khi cho 100µg với 2µg BSA (tỉ lệ QD–NH2:BSA=50:1), thì vạch trên gel điện di rất mờ, chứng tỏBSA đã phản ứng hết hoàn toàn (đường 1). Khi cho 100µg QD–NH2 phản ứng với 5µg BSA (tỉ lệ QD–NH2:BSA=20:1) thì ảnh điện di dịch nổi sau phản ứng cho thấy BSA vẫn còn dư, nhưng lượng dư là không nhiều (đường 2). Tiếp tục cho 100µg QD–NH2 phản ứng với 10µg BSA (QD–NH2:BSA=10:1) thì lượng BSA dư khá nhiều (đường 3). Qua phân tích trên cho thấy protein đã phản ứng với chấm lượng tử và chúng tôi lựa chọn tỉ lệ 100µg QD–NH2 phản ứng với 5µg BSA, tức là tỉ lệ giữa QD–NH2 và protein là 20:1 là tỉ lệ phù hợp. Tỉ lệnày được sử dụng cho các phản ứng tiếp sau.
Khả năng gắn kết của kháng thể đơn dòng với chấm lượng tử được phân tích bằng cách điện di dịch nổi sau phản ứng bằng phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (Hình 3.24). Kết quả điện di dịch nổi sau phản ứng của chấm lượng tử QD–COOH với kháng thể cho thấy không còn kháng thể trong dịch nổi(đường 1), chứng tỏ kháng thể đã phản ứng hết với QD–COOH.
Trong dịch nổi sau phản ứng QD–NH2với kháng thể cũng cho kết quảtương tự, không còn kháng thểdư trong dịch nổi (đường số 2), chứng tỏ kháng thểđã gắn hết với QD–NH2 và tủa xuống sau ly tâm. Kết quả phân tích này cho thấy rằng, kháng thểđơn dòng đã liên kết tạo phức hợp với chấm lượng tử (QD–COOH và QD–NH2).
Hình 3.23. Ảnh điện di dịch nổi sau phản ứng 100µg QD–NH2 với lượng BSA khác nhau sử dụng chất nối BS3
Hình 3.24. Kết quả điện di dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử. 1: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–COOH. 2: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–NH2. 3: Kháng thể đơn dòng C86030M khi chưa phản ứng với chấm lượng tử (3 vạch với khối lượng phân tử 30kDa, 50 kDa và 160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng của kháng thể và kháng thể hoàn chỉnh. 4: Thang protein.
Như vậy, sự tạo phức hợp chấm lượng tử với BSA đã được phân tích bằng phương pháp FESEM và phương pháp điện di biến bính protein trên gel polyacrylamide. Phức hợp chấm lượng tử với kháng thể cũng đã được chứng minh bằng phương pháp điện di biến bính protein trên gel polyacrylamide.
3.4. Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes
Việc chứng minh phức hợp hạt từ với kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn sẽ là tiền đề cho mục đích làm giàu vi khuẩn bằng hạt từ. Ngoài ra còn đem lại khả năng ứng dụng cao trong các cảm biến miễn dịch và kít chẩn đoán. Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi đã tạo phức hợp hạt từ Dynabeads và hạt từ chitosan với kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes và chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu của chúng với vi khuẩn
L. monocytogenes. Vì kích thước của hạt từ Dynabeads là 1µm trong khi kích thước của hạt từ chitosan là 20nm nên chúng tôi sử dụng hạt từDynabeads để dễ dàng cho việc quan sát, chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học. Chúng tôi đã chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu vi khuẩn L. monocytogenes của phức hợp hạt từ Dynabeads kháng thể đơn dòng theo hai cách: (1) Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng bắt vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch (cho mục đích ứng dụng làm giàu vi khuẩn); (2) Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng liên kết với vi khuẩn L. monocytogenes sau khi được li giải trên màng nitrocellulose (cho mục đích ứng dụng trong cảm biến và kít chẩn đoán nhanh).
3.4.1. Liên kết trong dung dịch
Ủ hạt từ Dynabeads với vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch đệm TBS trong 30 phút để hạt từ có đủ thời gian phản ứng với vi khuẩn. Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng với vi khuẩn được tạo thành được chứng minh bằng phương pháp nhuộm Gram. Sau khi nhuộm Gram, sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát.
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hóa lí của thành tế bào bằng chất nhuộm. Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khảnăng giữ phức hợp tím tinh thể - iot. Lớp thành tế bào peptidoglycan của vi khuẩn Gram âm lại mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài. Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tếbào Gram dương, từ đó làm giảm
khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên trong tế bào. Vi khuẩn L. monocytogenes là vi khuẩn Gram dương