Hạt từ Dynabeads có nhóm carboxyl (xem chương 3). Phản ứng tạo phức hợp giữa hạt từ Dynabeads với protein (BSA, kháng thể) được thực hiện sử dụng chất gắn 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC).
Quy trình tạo phức hợp hạt từ Dynabeads–protein Bước 1: Kích hoạt nhóm carboxyl bằng EDC
1. Lấy 100µg hạt từ Dynabeads vào ống nghiệm 2. Dùng nam châm giữ hạt từ, loại bỏ dịch tan.
3. Rửa hạt từ Dynabeads 3 lần với 100µl dung dịch MES 1x
4. Phân tán hạt từ Dynabeads vào 100µl dung dịch EDC10mg/ml trong MES, lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 40 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó loại bỏ dịch tan.
5. Rửa hạt từ Dynabeads đã kích hoạt 3 lần bằng 100µl dung dịch MES 1x
Bước 2: Gắn hạt từDynabeads đã kích hoạt với protein
6. Phân tán hạt từ Dynabeads đã kích hoạt vào 20µl dung dịch chứa 5µg BSA trong MES 1x, lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng với tốc độ 200 vòng/phút 7. Thu phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA (MP–EDC–BSA) bằng nam châm.
Dịch tan phân tích bằng phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide.
8. Rửa MP–EDC–BSA 3 lần bằng 100µl dung dịch PBS-T 9. Phân tán vào 10µl dung dịch PBS-T, bảo quản ở 4oC.
Phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA được phân tích bằng phương pháp phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR),kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử quét phân giải cao(FESEM) (xem mục 2.2.3).
Phản ứng tạo phức hợp của hạt từ Dynabeads với kháng thểđơn dòng được thực hiện giống như với BSA. Trong đó lượng kháng thể là 5mg/ml. Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thểđơn dòng được sử dụng cho thí nghiệm kiểm tra sự liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes (xem mục 2.2.4.1).
Để tối ưu hóa lượng protein phản ứng với hạt từ, chúng tôi đặt phản ứng 100µg hạt từ Dynabeads với lần lượt 3µg, 5µg và 7µg BSA theo quy trình như trên. Dịch tan sau phản ứng được giữ lại và phân tích bằng phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (xem mục 2.2.3).