Chấm lượng tử có nhóm carboxyl (QD–COOH)
Để gắn protein với QD–COOH, chúng tôi sử dụng EDC làm chất nối. Quy trình thực hiện phản ứng được tiến hành theo hai bước như mục 3.1. để tránh EDC làm các protein liên kết lại với nhau.
Chấm lượng tử có nhóm amin (QD–NH2)
Để gắn protein với QD–NH2, chúng tôi sử dụng BS3 làm chất nối. Hai nhóm N-Hydroxysuccinimide–ester (NHS-ester) như nhau ởhai đầu phân tử của BS3 có khả năng phản ứng với nhóm amin trên chấm lượng tử và nhóm amin của protein. Để tránh BS3 nối hai nhóm amin của phân tử protein với nhau, chúng tôi đã thực hiện phản ứng theo hai bước.
o Bước 1: BS3 phản ứng với nhóm amin trên bề mặt QD–NH2 tạo ra phức hợp QD–chất nối (Hình 3.19). Hỗn hợp dung dịch được li tâm để giữ lại kết tủa QD–chất nối và loại bỏ dịch tan chứa BS3 dư.
o Bước 2: Tạo phức hợp chấm lượng tử với protein. Kết quả là protein được liên kết với chấm lượng tử thông qua cầu nối trung gian tạo thành phức hợp QD–BS3–kháng thể (Hình 3.20).
Hình 3.19.Sơ đồ phản ứng NHS-ester với chấm lượng tử
Hình 3.20. Sơ đồ phản ứng gắn protein lên QD–NH2 bằng BS3
Kết quả tạo phức hợp chấm lượng tử–BSA được phân tích bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) và phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide.
QD–NH2 trước khi tạo phức hợp với protein là các hạt có kích thước từ 100nm đến 400nm (Hình 3.21 a). Sau khi QD–NH2 tạo phức hợp với protein, các hạt bị phân tách thành các hạt nhỏ có kích thước khá đồng đều, khoảng 10nm (Hình 3.21 b). Sự khác biệt này cho thấy, protein đã tương tác với chấm lượng tử, hình thành thêm lớp chất hữu cơ trên bề mặt làm các chấm lượng tử phân tách nhau tốt hơn.
Hình 3.21.Ảnh FESEM của QD–NH2trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp với kháng thểđơn dòng QDs_chất nối QD–chất nối BS3 QD–NH2 QD–chất nối Protein Protein–QD a b
Kết quả chụp FESEM chấm lượng tử có nhóm carboxyl (QDs–COOH) trước khi tạo phức hợp với protein cho thấy các chấm lượng tử này bị kết tụ lại với nhau thành các cụm hạt (Hình 3.22 a). Sau khi QD–COOH được tạo phức hợp với protein thì các cụm hạt đã phân tách thành các hạt rời rạc phân tách nhau, kích thước của hạt rất đồng đều (khoảng 10nm-20nm) (Hình 3.22 b). Điều này chứng tỏ các protein đã phản ứng với QD–COOH tạo thành phức hợp chấm lượng tử–protein.
Hình 3.22. Ảnh FESEM của QD–COOH trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp với kháng thểđơn dòng
Chúng tôi đã tối ưu lượng protein phản ứng với chấm lượng tử bằng cách cho 100µg QD–NH2 phản ứng lần lượt với 2µg, 5µg và 10µg BSA và đánh giá sản phẩm bằng phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (Hình 3.23). Khi cho 100µg với 2µg BSA (tỉ lệ QD–NH2:BSA=50:1), thì vạch trên gel điện di rất mờ, chứng tỏBSA đã phản ứng hết hoàn toàn (đường 1). Khi cho 100µg QD–NH2 phản ứng với 5µg BSA (tỉ lệ QD–NH2:BSA=20:1) thì ảnh điện di dịch nổi sau phản ứng cho thấy BSA vẫn còn dư, nhưng lượng dư là không nhiều (đường 2). Tiếp tục cho 100µg QD–NH2 phản ứng với 10µg BSA (QD–NH2:BSA=10:1) thì lượng BSA dư khá nhiều (đường 3). Qua phân tích trên cho thấy protein đã phản ứng với chấm lượng tử và chúng tôi lựa chọn tỉ lệ 100µg QD–NH2 phản ứng với 5µg BSA, tức là tỉ lệ giữa QD–NH2 và protein là 20:1 là tỉ lệ phù hợp. Tỉ lệnày được sử dụng cho các phản ứng tiếp sau.
Khả năng gắn kết của kháng thể đơn dòng với chấm lượng tử được phân tích bằng cách điện di dịch nổi sau phản ứng bằng phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (Hình 3.24). Kết quả điện di dịch nổi sau phản ứng của chấm lượng tử QD–COOH với kháng thể cho thấy không còn kháng thể trong dịch nổi(đường 1), chứng tỏ kháng thể đã phản ứng hết với QD–COOH.
Trong dịch nổi sau phản ứng QD–NH2với kháng thể cũng cho kết quảtương tự, không còn kháng thểdư trong dịch nổi (đường số 2), chứng tỏ kháng thểđã gắn hết với QD–NH2 và tủa xuống sau ly tâm. Kết quả phân tích này cho thấy rằng, kháng thểđơn dòng đã liên kết tạo phức hợp với chấm lượng tử (QD–COOH và QD–NH2).
Hình 3.23. Ảnh điện di dịch nổi sau phản ứng 100µg QD–NH2 với lượng BSA khác nhau sử dụng chất nối BS3
Hình 3.24. Kết quả điện di dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử. 1: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–COOH. 2: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–NH2. 3: Kháng thể đơn dòng C86030M khi chưa phản ứng với chấm lượng tử (3 vạch với khối lượng phân tử 30kDa, 50 kDa và 160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng của kháng thể và kháng thể hoàn chỉnh. 4: Thang protein.
Như vậy, sự tạo phức hợp chấm lượng tử với BSA đã được phân tích bằng phương pháp FESEM và phương pháp điện di biến bính protein trên gel polyacrylamide. Phức hợp chấm lượng tử với kháng thể cũng đã được chứng minh bằng phương pháp điện di biến bính protein trên gel polyacrylamide.
3.4. Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes
Việc chứng minh phức hợp hạt từ với kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn sẽ là tiền đề cho mục đích làm giàu vi khuẩn bằng hạt từ. Ngoài ra còn đem lại khả năng ứng dụng cao trong các cảm biến miễn dịch và kít chẩn đoán. Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi đã tạo phức hợp hạt từ Dynabeads và hạt từ chitosan với kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes và chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu của chúng với vi khuẩn
L. monocytogenes. Vì kích thước của hạt từ Dynabeads là 1µm trong khi kích thước của hạt từ chitosan là 20nm nên chúng tôi sử dụng hạt từDynabeads để dễ dàng cho việc quan sát, chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học. Chúng tôi đã chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu vi khuẩn L. monocytogenes của phức hợp hạt từ Dynabeads kháng thể đơn dòng theo hai cách: (1) Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng bắt vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch (cho mục đích ứng dụng làm giàu vi khuẩn); (2) Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng liên kết với vi khuẩn L. monocytogenes sau khi được li giải trên màng nitrocellulose (cho mục đích ứng dụng trong cảm biến và kít chẩn đoán nhanh).