Ủ hạt từ Dynabeads với vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch đệm TBS trong 30 phút để hạt từ có đủ thời gian phản ứng với vi khuẩn. Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng với vi khuẩn được tạo thành được chứng minh bằng phương pháp nhuộm Gram. Sau khi nhuộm Gram, sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát.
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hóa lí của thành tế bào bằng chất nhuộm. Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khảnăng giữ phức hợp tím tinh thể - iot. Lớp thành tế bào peptidoglycan của vi khuẩn Gram âm lại mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài. Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tếbào Gram dương, từ đó làm giảm
khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên trong tế bào. Vi khuẩn L. monocytogenes là vi khuẩn Gram dương nên sẽ bắt giữ phức hợp tím tinh thể - iot.
Hình 3.25. Ảnh nhuộm Gram. (a) Vi khuẩn L. monocytogenes. (b) Phức hợp hạt từ Dynabeads BSA. (c) Phức hợp hạt từ Dynabeads kháng thể đơn dòng sau khi bắt vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch. (d) Đối chứng: Phức hợp hạt từ Dynabeads BSA sau khi ủ vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch
Trước hết, vi khuẩn L. monocytogenes và hạt từđược nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi quang học. Vi khuẩn L. monocytogenes có dạng hình que, kích thước 1,5µm x 0,5µm và có màu tím xanh sau nhuộm Gram (Hình 3.25 a).
Trong khi đó, hạt từ Dynabeads là các hạt hình tròn đường kích 1µm màu đỏ nâu (Hình 3.25 b).
Sau khi nhuộm Gram phức hợp hạt từ kháng thể sau khi tiếp xúc với vi khuẩn, hình ảnh cho thấy hạt từ Dynabeads màu đỏ nâu nằm sát cạnh vi khuẩn màu tím xanh nằm cạnh nhau (Hình 3.25 c góc trái) hoặc che phủ lẫn nhau (Hình 3.25 c góc phải). Chứng tỏ hạt từ kháng thểđã giữ lại được vi khuẩn. Để đối chứng, phức hợp hạt từ Dynabeads BSA (không có kháng thể đơn dòng đặc hiệu) được ủ với vi khuẩn L. monocytogenes tương tự như trên rồi nhuộm Gram thì trên ảnh chỉ quan sát được hạt từ mà không thấy xuất hiện một vi khuẩn nào (Hình 3.25 d). Chứng tỏ phức hợp hạt từ Dynabead-kháng thể đơn dòng đã bắt đặc hiệu vi khuẩn L. monocytogenes.