trong dung dịch
Đặt phản ứng giữa phức hợp hạt từ Dynabeads – kháng thểđơn dòng với vi khuẩn L. monocytogenes
1. Phân tán đều 10µl phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng vào 89µl TBS1x
2. Thêm 1µl dịch vi khuẩnL. monocytogenes106 cfu/ml, trộn đều, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc tròn với tốc độ 200 vòng/phút.
3. Dùng nam châm giữ lại hạt từ, loại bỏ dịch tan.
4. Rửa hạt từ 5 lần bằng 100µl dung dịch PBS-T, rửa 3 lần bằng 100µl dung dịch TBS 1x.
Phân tán lại vào 10 µl TBS 1x, bảo quản 4oC.
Thực hiện tương tự với đối chứng âm: hạt từ Dynabeads không gắn kháng thểđơn dòng kháng L. monocytogenes mà gắn BSA.
Kiểm tra sự liên kết đặc hiệu của phức hợp hạt từ Dynabeads với vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
1. Chuẩn bị 4 phiến kính và nhỏ lên mỗi kính lượng mẫu như sau:
Bảng 2.10. Các mẫu nhuộm Gram
Kính 1 Đối chứng: 5µl NaCl 0,9% + 1µl L. monocytogenes 108 cfu/ml
Kính 2 Đối chứng: 5µl NaCl 0,9% + 1µl phức hợp hạt từ Dynabeads– BSA 1mg/ml
Kính 3
5µl NaCl 0,9% + 1µl phức hợp hạt từ Dynabeads – kháng thể đơn dòng sau phản ứng với vi khuẩn L. monocytogenes 108 cfu/ml
Kính 4 Đối chứng: 5µl NaCl 0,9% + 1µl phức hợp hạt từ Dynabeads– BSA sau phản ứng với vi khuẩn L. monocytogenes 108 cfu/ml 2. Để khô mẫu ở nhiệt độ phòng.
3. Hơ nhanh kính trên ngọn lửa đèn cồn 2–3 lần.
4. Nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 50 giây, sau đó rửa sạch bằng nước.
5. Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước. 6. Khử màu bằng rượu ethanol 90% trong 30 giây, rửa lại bằng nước, sau đó
làm khô ở nhiệt độ phòng.
7. Quan sát mẫu trên kính bằng kính hiển vi quang học (sử dụng vật kính 100x).
2.2.4.2. Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes
trên màng nitrocellulose
Li giải vi khuẩn trên màng nitrocelulose
Ngâm màng trong dung dịch đệm botting 3 lần, mỗi lần 5 phút. Nhỏ1µl dung dịch vi khuẩn L. monocytogenes lên màng nitrocellulose. Đặt màng này lên giấy thấm đã thấm các dung dịch li giải lần lượt theo thứ tự và thời gian thấm như sau:
1) Dung dịch SDS 10 phút 2) Dung dịch biến tính 5 phút 3) Dung dịch trung hòa 5 phút 4) Dung dịch trung hòa 5 phút 5) Dung dịch SSC 15 phút
Sau khi li giải xong, để bề mặt màng khô sau đó phủ màng bằng sữa tách béo 5% trong TTBS 1x trong 2 giờở nhiệt độ phòng trên máy rung lắc tròn.
Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes trên màng nitrocellulose
Sau khi phủ màng có dịch li giải vi khuẩn bằng sữa tách béo, rửa màng 3 lần bằng dung dịch TTBS 1x, mỗi lần 1 phút. Rửa lại màng 3 lần bằng TBS 1x, mỗi lần 5 phút. Nhỏlên màng 2µl kháng thểđơn dòng L. monocytogenesđã gắn hạt từ Dynabeads. Sau 30 giây, rửa màng bằng TTBS 1x trong 30 phút. Sau đó quan sát bằng kính hiển vi.
Thực hiện tương tự với các đối chứng âm: (1) Màng nitrocellulose có dịch li giải vi khuẩn E. coli; (2) Màng nitrocellulose không có vi khuẩn. Sau khi phủ màng bằng sữa tách béo, nhỏ 2µl kháng thểđơn dòng L. monocytogenes đã gắn hạt từDynabeads 1 và 2µl phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA lên màng 2. Sau 30 giây, rửa màng bằng TTBS trong 30 phút, quan sát bằng kính hiển vi quang học.
2.2.5. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes trên màng nitrocellulose bằng phức hợp hạt nano–kháng thể phức hợp hạt nano–kháng thể
2.2.5.1. Phát hiện bằng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể
Li giải vi khuẩn trên màng nitrocellulose tương tự mục 2.2.4.2.
Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng phức hợp kháng thể đơn dòng gắn chấm lượng tử
Rửa màng nitrocellulose đã chuẩn bị ở trên bằng TTBS 1x 3 lần, mỗi lần 1 phút và TBS 1x cũng 3 lần, mỗi lần 5 phút. Nhỏ 2µl kháng thể đơn dòng L.
monocytogenes đã gắn chấm lượng tử lên màng tại vị trí có dịch li giải vi khuẩn
L. monocytogenes. Tương tự với các đối chứng âm, nhỏ lần lượt 2µl kháng thể đơn dòng L. monocytogenes đã gắn chấm lượng tử lên màng tại vị trí không có vi khuẩn và tại vị trí có dịch li giải vi khuẩn E. coli. Sau 1 phút, rửa màng bằng TTBS 1x trong 5 phút. Soi và quan sát màng dưới đèn tử ngoại.
2.2.5.2. Phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn dòng gắn hạt vàng
Li giải vi khuẩn trên màng nitrocellulose tương tự mục 2.2.4.2.
Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng phức hợp kháng thể đơn dòng gắn hạt vàng
Rửa màng nitrocellulose đã chuẩn bị trước ở trên bằng TTBS 1x 3 lần, mỗi lần 1 phút và TBS 1x 3 lần, mỗi lần 5 phút. Nhỏ 2µl phức hợp kháng thể đơn dòng L. monocytogenes gắn hạt vàng (Biodesign) lên màng tại vị trí có dịch li giải vi khuẩn L. monocytogenes. Tương tự với các đối chứng âm, nhỏ lần lượt 2µl kháng thể đơn dòng L. monocytogenes gắn hạt vàng tại vị trí không có vi khuẩn và tại vị trí có dịch li giải vi khuẩn E. coli. Sau 1 phút, rửa màng bằng TTBS 1x trong 5 phút. Quan sát và chụp ảnh.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo phức hợp hạt từ Dynabeads–protein
Chúng tôi đã sử dụng hạt từ thương mại Dynabeads® My One Carboxylic Acid (gọi tắt là hạt từ Dynabeads) để tạo phức hợp với protein (albumin huyết thanh bò (BSA) và kháng thểđơn dòng kháng L. monocytogenes
(kháng thể)). Hạt từ này có đường kính 1µm, nồng độ 10 mg/ml và đã được chức năng hóa bề mặt với nhóm chức carboxyl (–COOH) (Hình 3.1).
Hình 3.1. Hình ảnh SEM của hạt từ Dynabeads® My One Carboxylic Acid Ở điều kiện bình thường nhóm carboxyl của hạt từ không phản ứng với nhóm amin của protein. Để xảy ra phản ứng cần kích hoạt nhóm carboxyl bằng phương pháp hóa học. Chúng tôi đã sử dụng một loại carbodiimide tan trong nước (1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC) trong dung dịch đệm 2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid (MES) pH 5,5. EDC kích hoạt nhóm carboxyl của hạt từ Dynabeads bằng cách phản ứng với nhóm chức carboxyl này để tạo thành một este không bền (Hình 3.2 a). Este này dễ dàng phản ứng với nhóm amin (–NH2) của protein để tạo liên kết amide (Hình 3.2 b). MES pH 5,5 được lựa chọn làm dung dịch đệm, vì MES không chứa các nhóm chức amin hay carboxyl nên không phản ứng với hạt từ đã kích hoạt hay EDC.
Điều đáng lưu ý là các protein cũng có chứa nhóm carboxyl, vì thế nếu trộn hạt từ với protein và EDC trong cùng một dung dịch thì EDC có thể kích hoạt cả nhóm carboxyl của protein. Nhóm carboxyl của protein sau khi được kích hoạt sẽ phản ứng với nhóm amin của protein tạo thành các phức hợp protein với
protein là điều không mong muốn. Chính vì thế để giải quyết vấn đề này chúng tôi thực hiện phản ứng theo 2 bước.
o Bước 1: Kích hoạt nhóm carboxyl của hạt từ Dynabeads bằng EDC. Sau đó tinh sạch hạt từ Dynabeads đã được kích hoạt nhóm carboxyl bằng cách dùng nam châm giữ lại hạt từ, bỏ dịch nổi có chứa EDC dư.
o Bước 2: Thêm protein (BSA hoặc kháng thể) vào dung dịch hạt từ Dynabeads đã được kích hoạt để tạo phức hợp hạt từ–protein.
Hình 3.2. Cơ chế gắn protein lên hạt từ Dynabeads sử dụng chất nối EDC Chúng tôi sử dụng BSA làm protein mô hình để thực hiện phản ứng tạo phức hợp với hạt từ Dynabeads và tối ưu hóa các điều kiện phản ứng. Sau đó, áp dụng các quy trình tạo phức hợp đã được tối ưu hóa cho kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes để thực hiện các thí nghiệm phát hiện vi khuẩn này.
Kết quả tạo phức hợp của hạt từ Dynabeads với protein được phân tích bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR), phương pháp kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) và phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide.
Sự tạo phức hợp hạt từ Dynabeads với BSA được chứng minh bằng cách so sánh, phân tích phổ FTIR của hạt từ Dynabeads trước và sau khi tạo phức hợp với protein (Hình 3.3). EDC Hạt từ Dynabead Protein a b
Hình 3.3. Phổ FTIR của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo phức với BSA
Trên phổ hồng ngoại của hạt từ Dynabeads trước khi tạo phức hợp với protein (Hình 3.3 a) có đỉnh hấp thụ tại tần số 563 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết Fe–O của sắt từ. Đỉnh hấp thụ tại tần số 2924 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết C–H trong –CH2. Đỉnh hấp thụ tại tần số 3398 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết O–H trong –COOH và đỉnh hấp thụ tại tần số
a
1570 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong COO–. Phổ FTIR khẳng định hạt từ Dynabeads là hạt sắt từ có nhóm carboxyl.
Trên phổ hồng ngoại của hạt từ Dynabeads sau phản ứng tạo phức hợp với protein sử dụng chất gắn EDC (Hình 3.3 b) vẫn có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của các liên kết Fe–O, C–H trong –CH2 và O–H trong –COOH. Trên phổ xuất hiện đỉnh hấp thụ mới đặc trưng cho liên kết amide tại tần số 1635 cm-1 không có ở hạt từDynabeads ban đầu. Chứng tỏ rằng nhóm amin của protein đã phản ứng với nhóm carboxyl trên hạt từđể tạo liên kết amide.
Bên cạnh đó, để đánh giá khả năng gắn kết của protein với hạt từ và tối ưu hóa khối lượng protein và hạt từ, dịch tan sau phản ứng giữa hạt từ Dynabeads (100µg) với BSA (3µg, 5µg, 7µg) được phân tích bằng phương pháp điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide (Hình 3.4). Hình ảnh gel điện di cho thấy, lượng protein còn lại trong dịch nổi sau phản ứng với hạt từ Dynabeads (đường số 3, số 5 và số 7) ít hơn so với khi chưa phản ứng (đường số 2, số 4 và số 6 tương ứng). Chứng tỏ rằng protein đã phản ứng với hạt từ Dynabeads tạo thành phức hợp hạt từ Dynabeads–protein, bị nam châm giữ lại nên lượng protein trong dịch tan sau phản ứng đã giảm đi. So sánh các lượng BSA đã phản ứng với hạt từ Dynabeads, lượng BSA còn lại ở đường số 3 hầu như không còn, lượng BSA còn lại ở đường số 5 ít hơn ở đường số 7, nên với 100µg hạt từ Dynabeads phản ứng với 5µg BSA là tỉ lệ tối ưu. Tỉ lệ khối lượng hạt từ Dynabeads và protein là 20:1 là tỉ lệ phù hợp. Tỉ lệ này được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp sau với BSA và kháng thể.
Hình 3.4. Điện di dịch tan sau phản ứng tạo phức hợp hạt từ Dynabeads với lượng protein BSA khác nhau. 2, 4, 6: BSA trước phản ứng. 3,5,7: BSA trong dịch tan sau phản ứng.
Hình thái của hạt từDynabeads trước và sau khi tạo phức với protein được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử quét phân
giải cao (FESEM). Hạt từDynabeads trước khi tạo phức hợp với protein có hình cầu, kích thước 1µm (Hình 3.5 a, Hình 3.6 a). Sau khi tạo phức hợp, hình dạng, kích thước của hạt từ Dynabeads gần như không thay đổi (Hình 3.5 b, Hình 3.6 b). Bề mặt của hạt từ Dynabeads sau khi tạo phức hợp với protein (Hình 3.6 a) không quan sát thấy sự thay đổi so với trước khi tạo phức hợp (Hình 3.6 b).
a b
Hình 3.5. Ảnh SEM của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp với protein BSA
a b
Hình 3.6. Ảnh FESEM của hạt từDynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp với protein BSA
Như vậy, chúng tôi đã tạo thành công phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA. Chúng tôi cũng đã tìm ra được tỉ lệ phản ứng phù hợp là 100µg hạt từ Dynabeads với 5µg protein. Phức hợp hạt từ Dynabeads–protein được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho những thí nghiệm tiếp sau. Quy trình tạo phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA được áp dụng để tạo phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes cho các thí nghiệm với vi khuẩn này.
3.2. Tạo phức hợp hạt từ chitosan–protein
Hạt từ chitosan là hạt từ (Fe3O4) được bọc lớp chitosan biến tính, kích thước trung bình 20nm được Viện Khoa học Vật liệu cung cấp. Chitosan biến tính có cấu trúc tương tự chitosan, nhưng nhóm hydroxyl ở vị trí C6’được thay thế bởi một nhóm carboxylic (Hình 3.7). Chitosan biến tính là một polymer hữu cơ ưa nước, mỗi monomer đều có nhóm hydroxyl (–OH), nhóm amin (– NH2) và nhóm carboxyl (–COOH), do đó nó có khảnăng tương thích sinh học [Zhu 2005 a b].
Hình 3.7. Sự hình thành của chitosan và chitosan biến tính trong nước Vì hạt từ được bọc chitosan biến tính (sau đây viết tắt là hạt từ chitosan) nên trên bề mặt của chúng có các nhóm chức nhóm carboxyl, nhóm amin. Protein là một phân tử cũng có cả nhóm carboxyl và nhóm amin. Vì vậy protein được gắn với hạt từ chitosan bằng 2 chất nối:
(1) 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC) nối nhóm –COOH của hạt từ với protein (kí hiệu là P) (Hình 3.8 a).
(2) bis[sulfosuccinimidyl] suberate (BS3) nối amin của hạt từ với nhóm amin của protein (Hình 3.8 b).
Hình 3.8. Mô hình hạt nano từ bọc chitosan biến tính sử dụng chất nối để tạo phức hợp với protein
6’ 6’
6’ 6’
Chitosan biến tính
Tương tự như đối với hạt từ Dynabeads, để tạo liên kết giữa nhóm carboxyl trên hạt từ chitosan với nhóm amin của protein chúng tôi đã sử dụng chất nối (EDC) trong môi trường MES pH 5,5.
Chất nối BS3 được sử dụng để tạo liên kết giữa nhóm amin trên hạt từ chitosan và nhóm amin của protein trong môi trường PBS pH 7,4. BS3 có hai nhóm N-Hydroxysuccinimide –ester (NHS-ester) như nhau ở hai đầu phân tử dễ dàng phản ứng với nhóm amin. Để tránh trường hợp BS3 còn dư sẽ gắn kết các protein lại với nhau chúng tôi đã thực hiện phản ứng theo hai bước.
o Bước 1: Tạo phức hợp hạt từ chitosan với chất nối bằng cách cho BS3 phản ứng với hạt từ chitosan trong môi trường PBS pH 7,4 (Hình 3.9a). Sau đó tinh sạch hạt từ chitosan – chất nối bằng cách dùng nam châm giữ lại hạt từ và loại bỏ dịch tan chứa BS3 dư.
o Bước 2: Bổ sung protein (BSA hoặc kháng thể đơn dòng) vào dung dịch hạt từ chitosan–chất nối để tạo phức hợp hạt từ chitosan với protein (Hình 3.9 b).
Phức hợp hạt từ chitosan–protein sau khi được tạo thành đã được phân tích bằng phương pháp phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR) và phương pháp kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM).
Hình 3.9.Cơ chế gắn protein lên hạt từ chitosan sử dụng chất nối BS3 So sánh phổ FTIR của hạt từ chitosan trước và sau khi gắn với protein. Trên phổ FTIR của hạt từ chitosan (Hình 3.10 a) có đỉnh hấp thụ tại tần số 559 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết hóa trị Fe–O của sắt từ. Đỉnh hấp thụ tại tần số 2924 cm-1đặc trưng cho dao động của liên kết C–H trong –CH2. Đỉnh hấp thụ tại tần số 3410 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên kết O–H trong
a
–COOH. Đỉnh hấp thụ tại tần số 1620 cm-1đặc trưng cho dao động của liên kết C=O của COO–.
Hình 3.10. Phổ FTIR của hạt từ chitosan (a) và hạt từ chitosan gắn BSA sử dụng chất nối EDC (b)
Hình 3.11. Phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn BSA khi sử dụng chất nối BS3(a) và khi không sử dụng chất gắn hay chất nối (b)
Trên phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn với protein sử dụng chất nối EDC (Hình 3.10 b) đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong COO– (1620 cm-1) dịch chuyển về đỉnh hấp thụ đặc trưng của liên kết C=O trong amide (1631 cm-1). Chứng tỏ rằng nhóm amin của protein đã phản ứng với nhóm carboxyl trên hạt từ để tạo liên kết amide.
Trên phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn protein có sử dụng chất nối BS3 (Hình 3.11 a) đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong COO– (1620 cm-1) dịch chuyển về đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động của liên kết C=O trong amide (1624 cm-1). Chứng tỏ rằng nhóm amin của protein đã phản ứng với nhóm amin trên hạt từ chitosan tạo thành liên kết amide.
Để đối chiếu, hạt từ chitosan và protein được ủ ở điều kiện tương tự như hai trường hợp trên nhưng không sử dụng chất nối. Phổ FTIR của phức hợp này (Hình 3.11 b) không có bất kì sự khác biệt nào về các đỉnh hay dải hấp thụ so với phổ FTIR của hạt từ chitosan ban đầu (Hình 3.10 a). Điều này chứng tỏ rằng, phải có mặt chất nối EDC hoặc BS3 thì mới xảy ra phản ứng hóa học tạo phức hợp giữa hạt từ chitosan và protein.
Như vậy, bằng phương pháp phân tích phổFTIR chúng tôi đã chứng minh được rằng phức hợp hạt từ chitosan–BSA đã được tạo thành công có sử dụng chất gắn EDC hoặc chất nối BS3.
a b
e
Hình 3.12. Ảnh FESEM của hạt từ chitosan gắn BSA với các tỉ lệ khối lượng