Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide là một trong những phương pháp cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nó cho phép phân tích định lượng và định tính protein.
Trước khi điện di protein được biến tính bằng SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite dithiotheitol (DDT) (Hình 2.4).
Protein di chuyển trong gel theo chiều từ cực âm sang cực dương của nguồn, quá trình di chuyển của phân tử protein sẽ phụ thuộc vào hai yếu tố là khối lượng phân tử protein và nồng độ các chất trong gel. Protein có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn protein có khối lượng phân tử nhỏ. Để đưa protein trong các mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo sự phân tách tốt người ta
thường sử dụng phương pháp điện di không liên tục (discontinuous gel) gồm 2 lớp gel, gel cô và gel tách. Gel cô có nồng độ thấp khoảng 4–5%, nằm phía trên nơi tạo giếng tra mẫu. Khi có điện trường các protein trong mẫu sẽ di chuyển vào trong gel cô và chúng sẽ dồn lại thành một băng mỏng ngay phía bên trên lớp gel tách, quá trình phân tách protein trong gel sẽ tốt hơn [3].Gel tách có nồng độ cao hơn gel cô (10-15%) và nằm phía dưới. Nó có tác dụng phân tách các protein có kích thước, khối lượng phân tử khác nhau chạy trong gel.
Hình 2.4. Mô hình cấu trúc của phân tửprotein trước và sau khi được biến tính bởi SDS
Bảng 2.6. Thành phần của một gel polyacrylamide
Thành phần Gel tách 12% (4 ml/1gel) Gel cô 5% (1,5 ml/1gel) H2O 1,32 ml 1,05 ml Acrylamid 30% 1,6 ml 250 µl Tris-HCl 1,5M pH 8.8 1 ml Tris-HCl 0,5M pH 6.8 190 µl SDS 10% 40 µl 15 µl APS 10% 40 µl 20 µl TEMED 4 µl 4 µl
Điện di kiểm tra lượng protein còn dư sau phản ứng gắn với hạt từ Dynabeads, đồng thời tối ưu hóa tỉ lệ phản ứng giữa hạt từ Dynabeads với protein
Lượng protein dư trong dịch tan sau phản ứng giữa hạt từ Dynabeads với lượng BSA khác nhau được phân tích bằng phương pháp điện di biến tính trên gel polyarcylamide, từ đó suy ra được lượng protein đã phản ứng với hạt từ Dynabead.
Chuẩn bị gel điện di
Chuẩn bị gel cô nồng độ 5% và gel tách nồng độ 12% (Bảng 2.). Sau khi cả hai gel đã hình thành, lắp đĩa gel vào bể điện di và rót dung dịch điện di vào bể.
Chuẩn bị mẫu
Bảng 2.7. Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng hạt từ Dynabead với BSA
Mẫu Thành phần mẫu
1 8µl Thang protein
2 Đối chứng 1,5µg BSA. Bổ sung 8,5µl MES 1x và 3µl đệm tra mẫu. 3 10µl dịch tan từ 20µl dịch tan sau phản ứng tạo phức của 100µg hạt từ
Dynabeads với 3µg BSA. Thêm 3µl đệm tra mẫu.
4 Đối chứng 2,5µg BSA. Bổ sung 7,5µl MES 1x và 3µl đệm tra mẫu. 5 10µl dịch tan từ 20µl dịch tan sau phản ứng tạo phức của 100µg hạt từ
Dynabeads với 5µg BSA. Thêm 3µl đệm tra mẫu.
6 Đối chứng 3,75µg BSA. Bổ sung 6,25µl MES 1x và 3µl đệm tra mẫu. 7 10µl dịch tan từ 20µl dịch tan sau phản ứng tạo phức của 50µg hạt từ
Dynabeads với 7µg BSA. Thêm 3µl đệm tra mẫu. Tất cả các mẫu đem biến tính ở 95oC trong 5 phút.
Tiến hành điện di
Chạy điện di 50 phút, 220V, 35 mA (cố định dòng). Sau điện di rửa gel bằng nước ấm, sau đó nhuộm gel bằng dung dịch thuốc nhộm Coomassie trong 2 giờ và rửa lại bằng nước.
Điện di xác định lượng BSA tối ưu trong phản ứng gắn với chấm lượng tử sử dụng BS3
Chuẩn bị mẫu
Bảng 2.8. Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng chấm lượng tử có nhóm amin (QD–NH2) với BSA
Mẫu Thành phần mẫu
1 16µl dịch tan từ 20µl dịch tan sau phản ứng 100µg QD–NH2 với 2µg BSA. Thêm 3µl đệm tra mẫu
2 16µl dịch tan từ 20µl dịch tan sau phản ứng 100µg QD–NH2 với 5µg BSA. Thêm 3µl đệm tra mẫu
3 16µl dịch tan từ 20µl dịch tan sau phản ứng 100µg QD–NH2 với 10µg BSA. Thêm 3µl đệm tra mẫu
Điện di kiểm tra lượng kháng thể còn dư sau phản ứng gắn với chấm lượng tử
Chuẩn bị mẫu
Bảng 2.9. Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng chấm lượng tử với kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes
Mẫu Thành phần mẫu
1 10µl dịch tan sau phản ứng 50µg QD–NH2 với 2,8µg kháng thể sử dụng chất nối EDC. Thêm 3µl đệm tra mẫu.
2 10µl dịch tan sau phản ứng 50µg QD–NH2 với 2,8µg kháng thể sử dụng chất nối BS3. Thêm 3µl đệm tra mẫu.
3 2,8µg kháng thể đơn dòng. Bổ sung thêm 9µl PBS1x và 3µl đệm tra mẫu.
2.2.4. Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes 2.2.4.1. Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes