chấm lượng tử hoặc gắn hạt vàng
Các tế bào vi khuẩn L. monocytogenes được ly giải bởi hóa chấm thấm qua giấy thấm và màng nitrocellulose. Sau ly giải, các protein của vi khuẩn bám vào màng nitrocellulose. Phức hợp hạt nano–kháng thểđược ứng dụng phát hiện các kháng nguyên vi khuẩn trên màng nitrocellulose. Đối chứng âm được sử dụng là dịch ly giải của vi khuẩn E. coli.
Sau khi nhỏ phức hợp chấm lượng tử–kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes lên vị trí tế bào li giải L. monocytogenes, quan sát dưới đèn tử ngoại thấy các chấm phát huỳnh quang đỏ tại vị trí có dịch ly giải tế bào L. monocytogenes. Trong khi đó, tại vị trí dịch ly giải vi khuẩn E. coli vị trí không có dịch li giải vi khuẩn thì không thấy các chấm phát sáng (Hình 3.29 a). Kết quả này chứng tỏ rằng, sử dụng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể đơn dòng phát hiện được vi khuẩn L. monocytogenes. Nồng độ vi khuẩn mà chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này là 106 cfu/ml.
Hình 3.29. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes sau khi li giải trên màng Nitrocellulose dùng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể (a) hoặc kháng thể phức hợp hạt vàng–kháng thể (b).
Tương tự phần trên, phức hợp hạt vàng–kháng thể đơn dòng (Biodesign) được nhỏ lên màng nitrocellulose và rửa bằng TTBS, tại vị trí ly giải vi khuẩn L. monocytogenes thấy xuất hiện vệt tròn màu hồng (màu của phức hợp hạt nano vàng – kháng thể), còn tại vị trí ly giải vi khuẩn E. coli và vị trí không có dịch li giải vi khuẩn thì không thấy màu (Hình 3.29 b). Màu hồng được nhìn thấy rõ ở nồng độ 106 cfu/ml và nhìn thấy mờ hơn khi nồng độ là 105 cfu/ml. Như vậy, sử
a
dụng phức hợp hạt vàng–kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes có thể phát hiện được vi khuẩn L. monocytogenes bằng mắt thường chỉ sau vài phút.
Như vậy phức hợp hạt nano–kháng thể đơn dòng đã phát hiện được trực tiếp vi khuẩn L. monocytogenes ở nồng độ 105-106 cfu/ml không cần công đoạn phá tế bào và tinh sạch kháng nguyên protein màng tế bào. Đây là phương pháp phát hiện nhanh, tiết kiệm chi phí và công sức. Tuy nhiên, vì lượng kháng nguyên trên màng tế bào là không nhiều nên tín hiệu màu còn yếu.
Đã có nhiều công trình phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng nhiều phương pháp khác nhau. Bằng phương pháp Dot blot, Siragusa phát hiện được vi khuẩn L. monocytogenes trên màng ở nồng độ 106 cfu/ml bằng cách sử dụng đồng vị phóng xạ P32 và enzyme HRP để đánh dấu kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, tín hiệu ở nồng độ này vẫn yếu (xem hình 1.6) [60]. Bằng phương pháp Western blot, tác giả Phạm Đức Minh đã phát hiện được vi khuẩn L. monocytogenes ở nồng độ 105 cfu/ml [3]. Tuy nhiên, bằng phương pháp này tác giả lại phải điện di proteintrước khi đưa lên màng. So với kết quả mà chúng tôi đạt được, phương pháp sử dụng các hạt phát quang (chấm lượng tử, hạt nano vàng) cho tín hiệu màu tốt hơn, không cần tinh sạch kháng nguyên mà phát hiện trực tiếp kháng nguyên sau khi được ly giải trên màng.
Để nâng cao độ nhạy và tín hiệu màu chúng tôi muốn kết hợp sử dụng hạt từ và chấm lượng tử (Hình 3.30). Do nồng độ vi khuẩn L. monocytogense trong dung dịch là không cao nên cần dùng phức hợp hạt từ–kháng thể đơn dòng để tăng nồng độ vi khuẩn trong dung dịch (làm giàu vi khuẩn). Sau đó, sử dụng phức hợp hạt vàng – kháng thểđơn dòng hoặc phức hợp chấm lượng tử–kháng thểđơn dòng để phát hiện vi khuẩn. Đây là một phương pháp có tính khả thi, có thểứng dụng trong các kênh vi lưu.
hạt nano–kháng thểđể phát hiện vi khuẩn
KẾT LUẬN
1. Hạt từ Dynabeads và hạt từ bọc chitosan biến tính đã được gắn với protein albumin huyết thanh bò (BSA) và kháng thể đơn dòng kháng
L.monocytogenes bằng phương pháp hóa học sử dụng các chất nối 1– ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC) hoặc bis [sulfosuccinimidy] suberate (BS3). Phức hợp tạo thành đã được phân tích bằng các phương pháp phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR), kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) và điện di trên gel polyacrylamide.
2. Chấm lượng tử đã được chức năng hóa bề mặt bằng các chất mercaptopropionic acid (MPA) và 2–aminoethanethiol (AET). Kết quả biến đổi bề mặt chấm lượng tử đã được khẳng định bằng phương pháp FTIR.
3. Chấm lượng tử sau khi chức năng hóa bề mặt đã được gắn với BSA và kháng thể đơn dòng bằng phương pháp hóa học sử dụng chất nối EDC hoặc BS3. Phức hợp tạo thành đã được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét phân giải cao và điện di trên gel polyacrylamide.
4. Đã chứng minh sự liên kết đặc hiệu của phức hợp hạt từ Dynabead– kháng thể đơn dòng với vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch và dịch li giải của vi khuẩn này trên màng nitrocellulose.
5. Phức hợp chấm lượng tử kháng thể đơn dòng và phức hợp hạt vàng kháng thể đơn dòng đã phát hiện được vi khuẩn L. monocytogenes sau khi vi khuẩn được li giải bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose. Đây là một phương pháp mới thực hiện đơn giản, phát hiện nhanh vi khuẩn không cần qua bước thu kháng nguyên tinh sạch.
ĐỀ NGHỊ
1. Nghiên cứu sử dụng phức hợp hạt từ–kháng thể làm giàu vi khuẩn
2. Nghiên cứu sử dụng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể hoặc phức hợp hạt vàng–kháng thể phát hiện vi khuẩn trong dung dịch sau khi được làm giàu bằng phức hợp hạt từ–kháng thể.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
1. Le Thi Hien, Nguyen Thi Hoa, Vu Thi Huyen, Nguyen Van Canh, Vu Ngoc Hoan and Nguyen Nang Dinh. The study of quantum dot surface change for antibody conjugate applied in molecular diagnostics. Abstract book of the International Workshop on Advanced Material and Nanotechnology 2012 (IWAMN 2012), 2012, Hanoi, Vietnam, pp.34. 2. Lê Thị Hiên, Vũ Thị Huyền, Nguyễn Thị Hòa, Vũ Xuân Nghĩa, Phạm
Đức Minh, Nguyễn Năng Đinh. Ứng dụng phức hợp hạt nano–kháng thể đơn dòng phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogene (Bản thảo gửi Tạp chí Y học Việt Nam).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Thị Kim Chi, Hiệu ứng kích thước ảnh hưởng lên tính chất quang của
CdS, CdSe và CuInS2, Luận án Tiến sĩ Khoa học Vật liệu, Viện Khoa học Vật liệu, Hà Nội, 2010, tr. 17–19.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương. (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.
3. Phạm Đức Minh, Vũ Xuân Nghĩa, Lê Thị Hiên, Nguyễn Năng Định. (2012), Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng phát hiện vi khuẩn
Listeria monocytogenes, Tạp chí y học Việt Nam, Số 1, tr. 22-24.
4. Ngô Đức Thế, Sơ lược về từ học và vật liệu từ, Tạp chí:
http://www.vatlyvietnam.org.
Tài liệu tiếng Anh
5. Alexiou C., Arnold W., Klein R. J., Parak F. G., Hulin P., Bergemann C., Erhardt W., Wagenpfeil S. and Lubbe A.S. (2000), Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting, CancerRes. 60 (23), pp. 6641–6648. 6. Alivisatos A.P. (1996), Semiconductor Clusters, Nanocrystals, and
Quantum Dots,Science, 271, pp. 933-937.
7. Amagliani G., Brandi G. Omiccioli E., Casiere A., Bruce I.J. and Magnani M. (2004), Direct detection of Listeria monocytogenes from milk by magnetic based DNA isolation and PCR, Food Microbiology, 21, pp. 597-603.
8. Boer D.E. and Beumer R.R. (1999), Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms, Int. J. Food Microbiol., 50,pp. 119– 130. 9. Cai W., Chen X. (2007), Nanoplatforms for targeted molecular imaging in
living subjects, Small., 3, pp. 1840-1854.
10. Centers for Disease Control and Prevention (2000), CDC Surveillance Summaries,MMWR.,49, No. SS-1.
11. Crowley E.L., O’Sullivan C.K. and Guilbault G.G. (1999), Increasing the sensitivity of Listeria moncytogenes assays: evaluation using ELISA and ampoteric detection, Analyst., 124, pp. 295– 299.
12. Churchill R.L.T., Lee H. and Hall J.C. (2006), Detection of Listeria monocytogenes and the toxin listeriolysin O in food, Journal of Microbiological Methods, 64, pp. 141–170.
13. Datta A.R., Moore M.A., Wentz B.A. and Lane J. (1993), Identification and Enumeration of Listeria monocytogenes by Nonradioactive DNA probe colony hybridization, App. Envir. Microbio., 59 (1), pp. 144-149.
14. Durham R.J., Mattingly J.A., Butman B.T.and Robison B.J. (1990), A monoclonal antibody enzyme immunoassay (ELISA) for the detection of Listeria in foods and environmental samples, Foodborne Listeriosis. Elsevier Science Publishers, New York, pp. 105–110.
15. Erdogan H.M., Cripps P.J. and Morgan K.L. (2002), Optimization of a culture technique for the isolation of Listeria monocytogenes from faecal samples, J Vet Med Infect Dis Vet Public Health, 49(10), pp. 502-506.
16. Ermolaeva S., Karpova T., Novella S., Wagner M., Scortti M., Tartakovskii I. and Vazquez-Boland J.A. (2003), A simple method for the differentiation of Listeria monocytogenes on induction of lecithinase activity by charcoal, International Journal of Food Microbiology, 82, pp. 87-94.
17. Erogbogbo F., Yong K. T., Roy I., Xu G. X., Paras N., Prasad and Swihart M.T.(2008), Biocompatible Luminescent Silicon Quantum Dots for Imaging of Cancer Cells, ACS Nano, 2, pp. 873–878.
18. Feldheim D.L., Marcel C.A.D. (2002), Metal Nanoparticles: Synthesis, Characterization and Applications, J. Phys. Chem. B, 300, pp.1 1202- 11208.
19. Fu Y. Z., Yuan R. (2005), J. Biochem. Biophys. Methods, 62, pp. 163-174. 20. Gaillard J.L., Berche P., Frehel C., Gouin E. and Cossart P. (1991), Entry
of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci, Cell., 65, pp.1127–1141.
21. Gangar V., Curiale M.S., D’Onorio A., Schultz A., Johnson R.L. and Atrachie V. (2000), VIDAS enzyme-linked immunofluorescent assay for detection of Listeria in foods: collaborative study, J.AOAC Int., 83, pp. 903– 918.
22. Gasanov U., Hughes D. and Hansbro P.M. (2005), Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: a review, FEMS Microbiology Review, 29, pp. 851-875.
23. Gombas D.E., Chen Y., Clavero R.S. and Scott V.N. (2003), Survey of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods, J. Food. Prot., 66, pp. 559-569.
24. Goodwin S., Peterson C., Hob C. and Bittner C. (1999), Targeting and retention of magnetic targeted carriers (MTCs) enhancing intra-arterial chemotherapy, J. Magn. Magn. Mater., 194, pp. 132–139.
25. Goodwin S.C., Bittner C.A., Peterson C.L. and Wong G. (2001), Single-dose toxicity study of hepatic intra-arterial infusion of doxorubicin coupled to a novel magnetically targeted drug carrier, Toxicol. Sci., 60, pp. 177–183. 26. Hai N.H., Lemoine R., Remboldt S., Strand M., Shield J.E., Schmitter D.,
Kraus R.H., Espy M. and Leslie-Pelecky D.L. (2005), J. Magn. Magn. Mater., 293, pp. 75-79.
27. Hofmann W.K., Vos D.S., Komor M., Hoelzer D., Wachsman W. and Koeffler H.P. (2002), Characterization of gene expression of CD34+ cells from normal and myelodysplastic bone marrow Blood, 100, pp. 3553–3560. 28. Hough A.J., Harbion S.A., Savill M.G., Melton L.D. and Fletcher G.
(2002), Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in artificially contaminated cabbage using real-time polymerase chain reaction, J Food Prot, 65, pp. 1329-1332.
29. ISO (1996), Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes.
30. Kreibig U.V.M. (1995), Optical Properties of Metal Clusters, Springer, 25, pp. 532-538.
31. Lecuit M., Ohayon H., Braun L., Mengaud J. and Cossart P. (1997),
Internalin of Listeria monocytogenes with an intact leucine-rich repeat region is sufficient to promote internalization, Infect. Immu., 65 (12), pp. 5309–5319
32. Leonard P., Hearty S., Quinn J. and O’Kennedy R. (2004), A generic approach for detection of whole Listeria monocytogenes cells in contaminated samples using surface plasmon resonance, Biosens Bioelectron, 19, pp. 1331-1335.
33. Levin R.E. (2003). Application of the polymerase chain reaction for detection of Listeria monocytogenes in foods: a review of methodology. Food Biotechnol, 17, pp. 99-116.
34. Liberti P. A., Rao C.G. and Terstappen L. (2001), Optimization of ferrofluids and protocols for the enrichment of breast tumor cells in blood, J. Magn. Magn. Mater., 225, pp. 301-307.
35. Link S. E. (2003), Optical properties and ultrafast dynamics of metallic nanocrystals, Annu. ReV. Phys. Chem., 54, pp. 331-336.
36. Link S.E. (2005), Additions and corrections to” Simulation of the optical absorption spectra of gold nanorods as a function of their aspect ratio and effect of the medium dielectric constant, J.Phys. Chem. B, 109, pp. 10531- 10532.
37. Lubbe A. S., Bergemann C., Huhnt W., Fricke T., Riess H., Brock J. W. and Huhn D. (1996), Preclinical experiences with magnetic drug targeting: tolerance and efficacy, Cancer Res., 56, pp.4694–4701.
38. Lubbe A.S., Bergemann C., Riess H., Schriever F., Reichardt P., Possinger K, Matthias M., Doerken B., Herrmann F. and Guertler R. (1996), Clinical experiences with magnetic drug targeting: a phase I study with 4- epidoxorubicin in 14 patients with advanced solid tumors, Cancer Res., 56, pp. 4686–4693.
39. Mah C., Fraites T. J., Zolotukhin I., Song S., Flotte T.R., Dobson J., Batich C. and Byrne B.J. (2002), Improved method of recombinant AAV2 delivery for systemic targeted gene therapy, Mol. Therapy, 6, pp. 106–112.
40. Mazumder S., Dey R., Mitra M.k., Mukherjee S. and Das G.C. (2009),
Review: Biofunctionalized quantum dots in biology and medicine, Journal of Nanomaterials, 10, pp. 1-17.
41. McClure P. J., Roberts T. A. and Pguru P. O. (1989), Comparision of the effects of sodium chloride, pH and temperature on the growth of Listeria monocytogenes on gradient plates and liquid medium, Lett. Appl. Microbiol., 9, pp. 95-99.
42. Mitchell G. P., Mirkin C. A. and Letsinger R. L. (1999), Pro-grammed assembly of DNA functionalized quantum dots, Journal of the American Chemical Society, 121 (35), pp.8122–8123.
43. Mosbach K. and Schr¨oder U. (1979), Preparation and application of magnetic polymers for targeting of drugs, FEBS Lett., 102, pp. 112–116. 44. Nath N. and Chilkoti A. (2001), Interfacial Phase Transition of an
Environmentally Responsive Elastin Biopolymer Adsorber on Functionalizied Gold Nanoparticles Studied by Colloidal Surface Plasmon Resonance, Journal of the American Chemical Society, 123, pp. 8197-8202.
45. Nie Q.W., Tan B. and Zhang Y. (2006), Synthesis and characterization of monodisperse chitosan nanoparticles with embedded quantum dots, Nanotechnology, 17 (1), pp. 140-144.
46. Nogva H.K., Rudi K., Naterstad K., Holck A. and Lillehaug D. (2000),
Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk, Appl Environ Microbiol, 66, pp. 4266-4271.
47. Norton D.M. (2002), Polymerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes: toward real-time screening for food and environmental samples, J. AOAC Int., 85, pp. 505-515.
48. Odumeru J.A., Hedge V. and Leonvelarde C.G. (2005), Evaluation of New BBL
CHROMagar
Listeria for isolation of Listeria monocytogenes in foods, the 92nd annual International Association for Food Protection (IAFP) Meeting, Baltimore, MD.
49. Pandiripally V.K., Westbrook D.G., Sunki G.R. and Bhunia A.K. (1999),
Surface protein p104 is involved in adhesion of Listeria monocytogenes to human intestinal cell line, Caco-2. J. Med. Microbiol., 48, pp.117–124. 50. Paul F., Melville D., Roath S. and Warhurst D. (1981), A bench top
magnetic separator for malarial parasite concentration, IEEE Trans. Magn. MAG., 17, pp. 2822–2824.
51. Ramaswamy V., Cresence V.M., Rejitha J.S., Lekshmi M.U., Dharsana K.S., Prasad S.P. and Vijila H.M. (2007). Listeria – review of epidemiology and pathogenesis, J Microbiol Immunol Infect. 40 (1), pp. 4-13.
52. Rudi K., Naterstad K., Dromtorp S.M. and Holo H. (2005), Detection of viable and dead Listeria monocytogenes on gouda-like cheeses by real-time PCR, Lett Appl Microbiol, 40, pp. 301-306.
53. Ryser E.T. and Marth E.h. (1999), Listeria, Listeriosis and Food Safety, Marcel Dekker, Inc., New York.
54. Schlech W.F. 3rd. (1988), Virulence characteristics of L. monocytogenes. Food Technol, 42, pp.176–178.
55. Schlech W.F. 3rd. (2000), Foodborne listeriosis, Clin. Infect. Dis., 31, pp.770–775.
56. Seesod N., Nopparat P., Hedrum A., Holder A., Thaithong S., Uhlen M. and Lundeberg J. (1997), An integrated system using immunomagnetic separation, polymerase chain reaction, and colorimetric detection for diagnosis of Plasmodium Falciparum, Am. J. Tropical Med. Hygiene, 56, pp. 322–328.
57. Senyei A., Widder K. and Czerlinski C. (1978), Magnetic guidance of drug carrying microspheres, J. Appl. Phys., 49, pp. 3578–3583.
58. Sewell A.M., Warburton D.W., Boville A., Daley E.F. and Mullen K. (2003), The development of an efficient and rapid enzyme linked fluorescent assay method for the detection of Listeria spp. from foods. Int. J. Food Microbiol., 81, pp. 123–129.
59. Silbernagel K., Jechorek R., Kaufer A.L. and Johnson R.L. (2005),
in foods using Demi–Fraser and Fraser enrichment broths, as modification of AOAC Official Method 999.06 (AOAC Official Method 2004.06). J. AOAC Int., 88, pp. 750– 760.
60. Siragusa G.R. and Johnson M.G. (1990), Monoclonal antibody specific for Listeria monocytogenes, Listeria innicua and Listeria welshimeri, Applied and Environmental Microbiology, 56 (6), pp. 1897-1904.
61. Sutherland P.S. and Porritt R.J. (1997), L. monocytogenes. In: Foodbornemicroorganisms of public health significance, AIFST (NSWBranch) FoodMicrobiology Group.5th edn, pp. 333–378.
62. Walker S.J., Archer P., Banks J.G. (1990), Growth of Listeria monocytogenes at refrigeration temperatures, J. Appl. Bacteriol., 68, pp.157-162.
63. Wan J., King K., Forsyth S. and Coventry M.J. (2003), Detection of Listeria monocytogenes in salmon using the Probelia polymerase chain reaction system, J Food Prot, 66, pp. 436-440.
64. Wang H., Li Y. and Slavik M. (2007), Rapid detection of Listeria monocytogenes using quantum dots and nanobeads-based optical biosensor, Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology, 15, pp. 67-76.
65. Widder K.J., Morris R.M., Poore G.A., Howard D.P. and Senyei A.E.