4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplexPCR phát hiện nhanh và đồng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Độ đặc hiệu của kỹ thuật multiplex PCR được xây dựng trong đề tài nghiên cứu này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc phát hiện chính xác sự có mặt của các tác nhân gây bệnh quan tâm. Để xác định độ đặc hiệu của quy trình, kỹ thuật multiplex PCR đã xây dựng trong nghiên cứu này được thử nghiệm với các mẫu vi khuẩn S. typhi và S. aureus chuẩn cùng với các chủng vi khuẩn kiểm định thường có mặt trong thực phẩm nhưng không thuộc S. typhi và
S. aureus. Sản phẩm của phản ứng multiplex PCR trên các mẫu thử nghiệm này được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1,5%. Kết quả thử nghiệm được thể hiện trong hình 3.10 dưới đây.
Hình 3.10. Kết quả điện di kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR trên các chủng vi khuẩn kiểm định.
Đường chạy 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2: mẫu hỗn hợp S. typhi
YD và S. aureus BK; đường chạy 3: mẫu S. typhi YD; đường chạy 4: mẫu S. aureus
BK; đường chạy 5-15: các mẫu vi khuẩn kiểm định lần lượt là: Staphylococcus capitis, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Clostridium perfringens, Vibrio choleare, Listeria monocytogons, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus,
Bacillus subtilis, Clostridium botulinum, Shigella spp.
Kết quả hình 3.10 cho thấy, sản phẩm PCR trên đường chạy số 2 xuất hiện 2 băng DNA rõ nét có kích thước 439 bp và 615 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết. Ở đường chạy số 3 và số 4 mỗi đường chạy chỉ xuất
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hiện một băng DNA duy nhất, rõ nét tương ứng với kích thước 439 bp và 615 bp của S. aureus và S. typhi. Đối với các mẫu còn lại (ở đường chạy số 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) DNA được sử dụng không phải là S. aureus và S. typhi không xuất hiện sản phẩm PCR. Kết quả thử nghiệm cho thấy kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và S. typhi được phát triển trong nghiên cứu này có độ đặc hiệu đạt 100%.
Pui C. F. và cộng sự (2011) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời và sự khác biệt của vi khuẩn Salmonella spp, Salmonella typhi và
Salmonella typhimurium. Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình multiplex PCR có độ đặc hiệu 100% [63]. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng đã sử dụng multiplex PCR để xác định loài Staphylococci dương tính với coagulase, quy trình nghiên cứu đạt độ đặc hiệu 100% [67]. Freitas C. G. và cộng sự (2010) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh chóng và trực tiếp sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella enteritidis, S. typhi và S. typhimurium xuất hiện trong thịt gia cầm, độ đặc hiệu đạt 100% [33]. Nguyễn Vũ Trung (2009) đã nghiên cứu độ nhạy và độ đặc hiệu của multiplex PCR xác định trực tiếp Salmonella từ bệnh phẩm phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy độ đặc hiệu của của hệ thống multiplex PCR đạt 100% [11]. Như vậy quy trình phát hiện nhanh và đồng thời
S. aureus và S. typhi bằng kỹ thuật multiplex PCR của chúng tôi cũng đạt độ đặc hiệu tương tự như các công trình nghiên cứu đã được công bố.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 4
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
1. Đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân gen nuc của
Staphylococcus aureus phù hợp. Sử dụng phản ứng multiplex PCR đã phát hiện nhanh và đồng thời Salmonella typhi và Stapylococcus aureus khi sử dụng kết hợp với cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella typhi đã được công bố.
2. Đã xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Salmonella typhi và Stapylococcus aureus bằng kỹ thuật multiplex PCR. Thành phần phản ứng multiplex PCR tối ưu gồm 2,5 µl 10X PCR buffer; 1,5 µl 25mM MgCl2; 3,0 µl 2,5mM dNTPs; 1,0 µl mỗi mồi BS1 và BS2; 2,0 µl mỗi mồi NucF và NucR; 0,2 µl 5U/l DNA taq polymerase; 2,5 µl DNA khuôn và 9,3 µl H2O, điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng là giai đoạn biến tính ban đầu ở 95o
C trong 5 phút; 35 chu kỳ khuếch đại gồm biến tính ở 95oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55o
C trong 45 giây, kéo dài mồi ở 72oC trong 1 phút; pha kéo dài cuối cùng ở 72o
C
trong 5 phút.
3. Đã thử nghiệm so sánh giữa 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau gồm tách chiết bằng hóa chất và tách chiết bằng sốc nhiệt. Kết quả thể hiện không có sự khác biệt đáng kể khi DNA được tách chiết bằng 2 phương pháp trên.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
4. Đã xác định được độ nhạy của quy trình multiplex PCR là 1,8.10-4 ng DNA/µl đối với Salmonella typhi và 2,0.10-4 ng DNA/µl đối với
Staphylococcus aureus.
5. Đã thử nghiệm kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời
Staphyloccocus aureus và Salmonella typhi trên các chủng kiểm định. Kết quả cho thấy độ đặc hiệu của quy trình đạt 100%.
4.2. Kiến nghị
Tiếp tục thử nghiệm quy trình multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời
Staphyloccocus aureus và Salmonella typhi trên mẫu lây nhiễm nhân tạo và trên tập hợp nhiều mẫu bệnh phẩm để xây dựng bộ kít thử nghiệm phát hiện nhanh và đồng thời Staphyloccocus aureus và Salmonella typhi trong thực phẩm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt:
1. Nguyễn Văn Duy (2011), “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật DNA macroarray nhằm phát hiện nhanh tính kháng rifampicin và isoniazid ở vi khuẩn lao”, Luận án Tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội.
2. Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn và nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường phố, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế.
3. Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu (2005), Tình hình ô nhiễm thực phẩm do vi sinh vật tại hai xã huyện Kiến Xương tỉnh Thái Bình năm 2001, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế.
4. Đỗ Thị Hòa (2006), Phòng chống tụ cầu vàng, Khoa học phổ thông.
5. Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc tại Việt Nam năm 2008, dự
báo và giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế.
6. Nguyễn Lý Hương, Nguyễn thị Phấn, Bùi Thị Kim Dung (2005), Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật trên một số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tại các chợ ở Tp.Hồ Chí Minh trong 3 năm 2002-2004, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế.
7. Trần Thị Xuân Mai (2011), “Phát hiện nhanh Salmonella spp, Salmonella enterica hiện diện trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex- PCR)”, Tạp chí Khoa học, 20, tr. 198-208.
8. Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Kiều Nương (2003), Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2002, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế.
9. Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng ô nhiễm một số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ ở Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn trên thịt, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội. 10. Đỗ Ngọc Thúy (2006), “Đánh giá tình hình nhiễm một số loại vi khuẩn gây
bệnh trong thịt tươi trên địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 13(3), tr. 48-54.
11. Nguyễn Vũ Trung (2009), “Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định trực tiếp Salmonella từ bệnh phẩm phân”, Tạp chí Y học thực hành, (641)1, tr. 3-76.
Tiếng nƣớc ngoài:
12. Achtman M. (2008), "Evolution, Population Structure, and Phylogeography of Genetically Monomorphic Bacterial Pathogens", Annual Review of Microbiology, 62, pp. 53-70.
13. Agarwal A., Makker A., Goel S. K. (2002), “Application of the PCR technique for a rapid, specific and sensitive detection of Salmonella spp in foods”, Mol Cell Probes, 16, pp. 243-250.
14. Atanmassova V., Meindl A., Ring C. (2001), “Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococci enterotoxin in raw pork and uncooked smoked
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ham – a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR”,
International Journal of Food Microbiology, 68, pp. 105-113.
15. Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y., Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L.,Yamamoto K., Hiramatsu K. (2002), “Genome and virulence determinants of high virulence community- acquired MRSA”, Lancet, 359(9320), pp. 1819-1827.
16. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. (2008), “Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands”, J. Bacteriol, 190(1), pp. 300-310.
17. Baird R. M., Lee W. H. (1995), “Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus”, International Journal of Food Microbiology, 26, pp. 15-24.
18. Banavandi M. J. S., Shahhosseiny M. H., Shahbazzadeh D., V Karimi, Mirzahoseini H., Mahboudi F., Abachi M., Javadi G. (2004), “Selective Amplification of prt, tyv and invA Genes by Multiplex PCR for Rapid Detection of Salmonella typhi”, Iranian Biomedical Journal, 9(3), pp. 135-138.
19. Bannoehr J., Franco A., Iurescia M., Battisti A., Fitzgerald J. R. (2009), “Molecular diagnostic identification of Staphylococcus pseudintermedius”,
J Clin Microbiol, 47, pp. 469-471.
20. Bennett R. W., Lancette G. A. (2001), Bacteriological Analytical Manual Online (Chapter12: Staphylococcus aureus), Center for Food Safety & Applied Nutrition, U.S.Food and Drug Administration.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
21. Berke A., Tilton R. C. (1986), “Evaluation of Rapid Coagulase Methods for the Identification of Staphylococcus aureus”, Journal of clinical microbiology, 23(5), pp. 916-919.
22. Bes M., Saidi S. L., Becharnia F., Meugnier H., Vandenesch F., Etienne J., Freney J. (2002), “Population diversity of Staphylococcus intermedius iso- lates from various host species: typing by 16S-23S intergenic ribosomal DNA spacer polymorphism analysis”, J Clin Microbiol, 40, pp. 2275-2277. 23. Bhan M. K., Bahl R., Bhatnagar S. (2005), "Typhoid and paratyphoid
fever", Lancet, 366, pp. 749-762.
24. Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Pepe O., Coppola S. (2010), “Diversity of Staphylococcus species strains based on partial kat (catalase) gene se- quences and design of a PCR-restriction fragment length polymorphism assay for identification and differentiation of coagulase-positive species”, J Clin Microbiol, 48, pp. 192-201.
25. Brakstad O. G., Aasbakk K., Maeland J. A. (1992), “Detection of
Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene”, Journal of clinical microbiology, 30(7), pp. 1654-1660.
26. Bremer P. J., Fletcher G. C., Osbome C. (2004), “Staphylococcus aureus”,
Nee Zealand Institute for Crop and Food Research.
27. Brenner F. W., Villar R. G., Angulo F. J., Tauxe R., Swaminathan B. (2000), "Salmonella Nomenclature", Journal of Clinical Microbiology, 38,
pp. 2465-2467.
28. Carmo L. S., Dias R. S., Linardi V. R., Sena M. J., Santos D. A., Faria M. E., Pena E. C., Jett M., Heneine L. G. (2001), “Food poisoning enterotoxigenic strains of Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil”, Food Microbiology, 19, pp. 9-14.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 29. CDC (2002), Salmonella, United States.
30. Chaudhry R., Laxmi B. V., Nisar N., Ray K., Kumar D. (1997), “Standardisation of polymerase chain reaction for the detection of
Salmonella typhi in typhoid fever”, J Clin Pathol, 50, pp. 437-439.
31. Clelland M., Sanderson K. E., Clifton S. W., Latreille P., Porwollik S., Sabo A., Meyer R., Bieri T., Ozersky P., McLellan M., Harkins C. R., Wang C., Nguyen C., Berghoff A., Elliott G., Kohlberg S., Strong C., Du F., Carter J., Kremizki C., Layman D., Leonard S., Sun H., Fulton L., Nash W., Miner T., Minx P., Delehaunty K., Fronick C., Magrini V., Nhan M., Warren W., Florea L., Spieth J., Wilson R. K. (2004), "Comparison of genome degradation in paratyphi A and typhi, human-restricted serovars of
Salmonella enterica that cause typhoid", Nat Genet, 36, pp. 1268-74.
32. Dolapci I., Erdem B., Tekeli A. (2010), “Molecular analyses of Salmonella serotypentyphi and Salmonella serotype paratyphy B strain isolated in Turkey”, Turkey Journal Medical Science, 40(3),pp. 447- 458.
33. Freitas C. G., Santana A. P., Silva P. H., Gonçalves V. S., BarrosMde A., Torres F. A., Murata L. S., Perecmanis S. (2010), “PCR multiplex for detection of Salmonella Enteritidis, typhi and typhimurium and occurrence in poultry meat”, Int J Food Microbiol, 139(1-2), pp. 15-22.
34. Gibert I., Barbe J., Casadesus J. (1990), "Distribution of insertion sequence IS200 in Salmonella and Shigella", J Gen Microbiol, 136, pp. 2555-2560. 35. Gill S. R., Fouts D. E., Archer G. L., Mongodin E. F., Deboy R. T., Ravel
J., Paulsen I. T., Kolonay, J. F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R. J., Daugherty S. C., Madupu R., Angiuoli S. V., Durkin A. S., Haft D. H., Vamathevan J., Khour I. H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K., Kang K., Hance I. R., Nelson K. E., Fraser C.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
M. (2005), “Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain”, J. Bacteriol, 187, pp. 2426-2438.
36. Hashimoto Y., Itho Y., Fujinaga Y., Khan A. Q., Sultana F., Miyake M., Hirose K., Yamamoto H. (1995), “Devel-opment of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella typhi”, J Clin Microbiol, 33, pp. 775-777. 37. Hirose K., Itoh K. I., Nakajima H., Kurazono T., Yamaguchi M., Moriya K.,
Ezaki T., Kawamura Y., Tamura K., Watanabe H. (2002), “Selective Amplification oftyv (rfbE ), prt (rfbS ), viaB , and fliC Genes by Multiplex PCR for Identification of Salmonella enterica Serovars typhi and paratyphi
A”, Journal of Clinical Microbiology, 40(2), pp. 633-636.
38. Holden M. T., Feil E. J., Lindsay J. A., Peacock S. J., Day N. P., Enright M. C., Foster T. J., Moore C. E., Hurst L., Atkin R., Barron A., Bason N., Bentley S. D., Chilling W. C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin A., Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance Z., Harris B., Hauser H., Holroyd S., Jagels K., James K. D., Lennard N., Line A., Mayes R., Moule S., Mungall K., Ormond D., Quail M. A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B. G., Spratt B. G., Parkhill J. (2004), “Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance”, Proc Natl Acad Sci USA, 101(26), pp. 9786-9791.
39. Humphrey T. (2004), "Salmonella, stress responses and food safety",
Nature Reviews Micriobiology, 2, pp. 504-509.
40. Imen S. B., Ridha M., Makjoub A., (2007), Laboratory typing method for diagnostic of Salmonella strain, Monastir University Tunisia.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
41. Kathryn E. H., Wain J., Langridge G. C., Hasan Z. A. B., Quail M. A., Norbertczak H., Walker M. S. D., White B., Bason L., G., Mungall D. J. P. (2009), "Pseudogene accumulation in the evolutionary histories of
Salmonella enterica serovars paratyphi A and typhi", BMC Genomics, 10, pp. 1186-1471.
42. Kidgell C., Reichard U., Wain J., Linz B., Torpdahl M., Dougan G., Achtman M. (2002), "Salmonella typhi, the causative agent of typhoid fever, is approximately 50,000 years old", Infect Genet Evol, 2, pp. 39-45.
43. Kopecko L. H. J. (2002), "Salmonella typhi and paratyphi", Molecular Medical Microbiology, 5, pp. 1365-1391.
44. Kumar S., Balakrishna K., Batra H.V. (2005), Detection of Salmonella enterica serovar typhi ( S. typhi) by selective amplification of invA , viaB, fliC-d and prt genes by polymerase chain reaction in mutiplex format, Letters in Applied Microbiology.
45. Kuroda M., Ohta T., Uchiyama I., Baba T., Yuzawa H., Kobayashi I., Cui L., Oguchi A., Aoki K., Nagai Y., Lian J., Ito T., Kanamori M., Matsumaru H., Maruyama A., Murakami H., Hosoyama A., Mizutani U. Y., Takahashi N. K., Sawano T., Inoue R., Kaito C., Sekimizu K., Hirakawa H., Kuhara S., Goto S., Yabuzaki J., Kanehisa M., Yamashita A., Oshima K., Furuya K., Yoshino C., Shiba T., Hattori M., Ogasawara N., Hayashi H., Hiramatsu
K. (2001), “Whole genome sequencing of meticillin-resistant
Staphylococcus aureus”, Lancet, 357(9264), pp. 1225-1240.
46. Kwok A. Y., Chow A. W. (2003), “Phylogenetic study of Staphylococcus
and Macrococcus species based on partial hsp60 gene sequences”, Int J Syst Evol Microbiol, 53, pp. 87-92.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
47. Liu D., Verma N. K., Romana L. K., Reeves P. R. (1991), “Relationships among the rfb Regions of Salmonella Serovars A, B, and D”, Journal of Bacteriology, 173(15), pp. 4814-4819.
48. Madison B. M., Baselski V. S. (1983), “Rapid identification of