4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
3.2.3. Tối ưu phản ứng multiplexPCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus
Staphylococcus aureus và Salmonella typhi
Để tối ưu các điều kiện của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và S. typhi, trước tiên chúng tôi tiến hành tìm hiểu các điều kiện chung nhất của phản ứng PCR phát hiện riêng rẽ S. typhi và phản ứng PCR phát hiện riêng rẽ S. aureus.
Đối với phản ứng multiplex PCR, hàm lượng MgCl2, nhiệt độ gắn mồi đều ảnh hưởng đến khả năng khuếch đại đồng thời các trình tự đích trong mẫu phân tích [71]. Trong nghiên cứu này, các điều kiện về hàm lượng MgCl2, nhiệt độ gắn mồi trong các phản ứng PCR phát hiện S. aureus và phản ứng PCR phát hiện S. typhi được biến đổi nhằm tìm hiểu điều kiện chung nhất cho phép khuếch đại có hiệu quả vùng gen đặc hiệu của S. aureus và vùng gen đặc hiệu của S. typhi. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các điều kiện khác nhau này được thể hiện trong hình 3.4. dưới đây.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại của các phản ứng PCR phát hiện riêng rẽ S. typhi (đường chạy 1-12) và S. aureus (đường chạy 13-24) ở các điều kiện hàm lượng MgCl2 và nhiệt độ gắn mồi khác nhau.
Ghi chú các mẫu điện di trên hình 3.4:
Đường chạy Hàm lượng MgCl2 (mM) Nhiệt độ gắn mồi (oC) Đường chạy Hàm lượng MgCl2 (mM) Nhiệt độ gắn mồi (oC) Đường chạy Hàm lượng MgCl2 (mM) Nhiệt độ gắn mồi (oC) 1 1,50 53 9 1,50 57 17 1,50 55 2 1,50 53 10 1,50 57 18 1,50 55 3 2,25 53 11 2,25 57 19 2,25 55 4 3,00 53 12 3,00 57 20 3,00 55 5 1,50 55 13 1,50 53 21 1,50 57 6 1,50 55 14 1,50 53 22 1,50 57 7 2,25 55 15 2,25 53 23 2,25 57 8 3,00 55 16 3,00 53 24 3,00 57
- Đường chạy M: thang chuẩn DNA 1 kb.
- Đường chạy số 1, 5, 9, 13, 17, 21: các phản ứng kiểm chứng âm tính.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên hình 3.4 cho thấy các đường chạy số 3, 4, 6, 7, 8, 11 và 12 hình thành sản phẩm PCR tương ứng với kích thước 615 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR khuếch đại từ gen rfbE theo lý thuyết. Đường chạy số 14, 15, 16, 18, 19, 20, 23 và 24 hình thành sản phẩm PCR tướng ứng với kích thước 439 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR khuếch
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đại từ gen nuc. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 55oC và hàm lượng MgCl2 là 1,50 mM ( đường chạy số 6 và 18) cho hình ảnh băng điện di rõ nét cả ở sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi NucF-NucR và cặp mồi BS1-BS2. Vì vậy nhiệt độ gắn mồi là 55oC và hàm lượng MgCl2 trong phản ứng là 1,50 mM được chọn để thử nghiệm khả năng khuếch đại đồng thời của cả hai cặp mồi NucF-NucR và BS1-BS2 trong phản ứng multiplex PCR. Nồng độ của mỗi mồi được sử dụng là 0,6 µM và nồng độ DNA của phản ứng multiplex PCR được thử nghiệm là hỗn hợp gồm 1,8 ng/µl DNA tổng số của S. typhi và 2,0 ng/µl DNA tổng số của S. aureus. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR được thể hiện trong hình 3.5 dưới đây.
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR với cặp mồi BS1-BS2 và NucF-NucR ở nồng độ 0,6 µM sử dụng khuôn là hỗn hợp 1,8
ng/µl DNA tổng số của S. typhi và 2,0 ng/µl DNA tổng số của S. aureus.
M: Thang chuẩn DNA 100 bp; đường chạy số 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy số 2 và 3: mẫu kiểm chứng dương tính.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR ở hình 3.5 cho thấy, hai phản ứng dương tính đều xuất hiện 2 băng DNA rõ ràng. Trong đó, băng DNA thứ nhất có kích 615 bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen rfbE của S. typhi bởi cặp mồi BS1-BS2 và băng DNA thứ 2 có kích thước 439 bp tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen nuc của S. aureus bởi cặp mồi NucF-NucR. Kết quả này cho phép
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
khẳng định phản ứng multiplex PCR với hàm lượng MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng là 1,5 mM và nhiệt độ gắn mồi là 55oC hoàn toàn cho phép khuếch đại đặc hiệu các vùng gen mục tiêu tương ứng.
Tuy nhiên, khi so sánh cường độ giữa 2 băng sản phẩm DNA thu được của phản ứng multiplex PCR trong hình ảnh điện di trên cho thấy, cường độ băng sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi BS1-BS2 (băng có kích thước 615 bp) lớn hơn so với cường độ băng sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi NucF-
NucR (băng có kích thước 439 bp) mặc dù nồng độ DNA khuôn của S. typhi
và của S. aureus sử dụng trong phản ứng tương đương nhau. Điều này cho phép khẳng định, ở điều kiện nồng độ MgCl2 là 1,5 mM và nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR là 55oC, cặp mồi BS1-BS2 có hiệu quả khuếch đại cao hơn so với cặp mồi NucF-NucR.
Sự khác nhau trong hiệu quả khuếch đại giữa cặp mồi BS1-BS2 và NucF- NucR được giải thích như sau: nhiệt độ gắn mồi càng thấp thì hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR càng cao nhưng tính đặc hiệu càng giảm. Do đó, trong cùng hỗn hợp phản ứng multiplex PCR, cặp mồi nào có giá trị nhiệt độ biến tính của mồi (Tm) lớn hơn sẽ có hiệu quả khuếch đại cao hơn so với cặp mồi còn lại. Trong nghiên cứu này, các mồi NucF, Nuc R và BS1 đều có nhiệt độ biến tính là 54oC trong khi đó giá trị Tm của mồi BS2 là 57oC. Chính sự khác nhau trong giá trị Tm của mồi này là nguyên nhân dẫn đến hiệu quả khuếch đại của cặp mồi BS1-BS2 cao hơn so với cặp mồi NucF-NucR trong cùng 1 phản ứng PCR.
Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng quy trình kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi và S. aureus trong mẫu phân tích một cách hiệu quả; khi số tế bào S. typhi và S. aureus trong mẫu phân tích tương đương nhau thì cường độ băng sản phẩm phân tích cũng phải tương đương nhau. Kết quả này có ý nghĩa nhất định trong việc đánh giá sơ bộ mật độ tế bào tụ cầu vàng và tế bào vi khuẩn thương hàn trong mẫu phân tích. Do đó, phản
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ứng multiplex PCR cần tiếp tục được nghiên cứu tối ưu hàm lượng cặp mồi BS1-BS2 và NucF-NucR theo hướng tăng hàm lượng của cặp mồi NucF-NucR so với hàm lượng cặp mồi BS1-BS2 trong hỗn hợp phản ứng PCR.
Để tối ưu cặp mồi BS1-BS2 và cặp mồi NucF-NucR trong phản ứng multiplex PCR, phản ứng multiplex PCR đã được thử nghiệm với các điều kiện nồng độ cặp mồi như sau:
-Thí nghiệm 1: hỗn hợp phản ứng PCR có chứa 0,4 µM mồi BS1; 0,4 µM
mồi BS2; 0,6 µM mồi NucF và 0,6 µM mồi NucR.
-Thí nghiệm 2: hỗn hợp phản ứng PCR có chứa 0,4 µM mồi BS1; 0,4 µM
mồi BS2; 0,8 µM mồi NucF và 0,8 µM mồi NucR.
-Thí nghiệm 3: hỗn hợp phản ứng PCR có chứa 0,6 µM mồi BS1; 0,6 µM
mồi BS2; 0,8 µM mồi NucF và 0,8 µM mồi NucR.
Sản phẩm của phản ứng multiplex PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR được thể hiện trong hình 3.6 dưới đây.
Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các nồng độ mồi khác nhau.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đường chạy M: Thang chuẩn DNA 100 bp Đường chạy 1: Mẫu kiểm chứng âm tính
Đường chạy 2: hỗn hợp phản ứng PCR có chứa 0,4 µM mồi BS1; 0,4 µM mồi BS2; 0,6 µM mồi NucF và 0,6 µM mồi NucR
Đường chạy 3: hỗn hợp phản ứng PCR có chứa 0,4 µM mồi BS1; 0,4 µM mồi BS2; 0,8 µM mồi NucF và 0,8 µM mồi NucR
Đường chạy 4: hỗn hợp phản ứng PCR có chứa 0,6 µM mồi BS1; 0,6 µM mồi BS2; 0,8 µM mồi NucF và 0,8 µM mồi NucR
Kết quả điện di trong hình 3.6 cho thấy trong phản ứng multiplex PCR, cặp mồi NucF-NucR có hiệu quả khuếch đại kém hơn so với cặp mồi BS1-BS2 thể hiện ở cường độ băng thu được của cặp mồi BS1-BS2 khuếch đại gen rfbE rõ hơn so với cường độ băng của cặp mồi NucF-NucR khuếch đại gen nuc. Khi gia tăng hàm lượng cặp mồi NucF-NucR so với hàm lượng cặp mồi BS1-BS2 thì cường độ băng điện di cũng tăng theo. Ở đường chạy số 3 cho thấy khi thay đổi hàm lượng cặp mồi NucF-NucR gấp đôi so với hàm lượng cặp mồi BS1-BS2 thì cường độ hai băng điện di là tương đương nhau, đáp ứng được sự khuếch đại đồng thời cả 2 trình tự gen đích.
Từ những kết quả nghiên cứu trên cho phép kết luận rằng điều kiện tối ưu cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời tụ cầu vàng
Staphylococcus aureus và vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi xây dựng trong nghiên cứu này cụ thể như sau:
Thành phần phản ứng PCR bao gồm:
- 10x PCR Buffer: 2,5 µl
- MgCl2 (25 mM): 1,5 µl
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Mồi BS1 (10 µM): 1,0 µl
- Mồi BS2 (10 µM): 1,0 µl
- Mồi NucF (10 µM): 2,0 µl
- Mồi NucR (10 µM): 2,0 µl
- DNA taq polymerase (5 U/µl): 0,2 µl
- DNA khuôn: 2,5 µl
- Nước khử ion: 9,3 µl
Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng multiplex PCR bao gồm các giai đoạn sau:
- Giai đoạn biến tính ban đầu: 95oC trong 5 phút
- Giai đoạn khuếch đại gồm 35 chu kì bao gồm các bước:
+ Biến tính: 95o
C trong 30 giây
+ Gắn mồi: 55o
C trong 45 giây
+ Kéo dài mồi: 72o
C trong 60 giây
- Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72oC trong 5 phút
- Giai đoạn ủ bảo quản: 4oC cho đến khi lấy sản phẩm