4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
3.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplexPCR phát hiện nhanh và đồng thờ
đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi
Để phát hiện nhanh Salmonella typhi bằng phản ứng PCR, chúng tôi sử dụng cặp mồi đã được công bố trước đây bởi Mousavi S. L. và cộng sự năm 2006 [54]. Do đó, để phát hiện nhanh và đồng thời cả Salmonella typhi và Staphylococcus aureus, nhiệm vụ tiếp theo của đề tài này là thiết kế được cặp mồi đặc hiệu cho S. aureus đồng thời thỏa mãn được các điều kiện của phản ứng multiplex PCR. Dựa trên các công bố trước đây, gen mã hóa cho enzyme nuclease chịu nhiệt (nuc) đã được lựa chọn để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho S. aureus.
Gen rfbE là gen mã hóa protein vận chuyển màng CDP-tyvelose epimerase ở S. typhi. Nhiều công trình trên thế giới đã được công bố sử dụng gen rfbE làm chỉ thị để phát hiện S. typhi. Mousavi S. L. và cộng sự (2006) đã sử dụng gen
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
rfbE làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi bằng phương pháp PCR-ELISA, cặp mồi BS1 và BS2 đã được sử dụng để khuếch đại gen rfbE , kết quả của nghiên cứu cho thấy quy trình có độ đặc hiệu đạt 100%, giới hạn phát hiện trong PCR- ELISA là 2,5ρg DNA, toàn bộ quy trình mất khoảng 100 phút [54]. Liu D. và cộng sự (1991) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa các vùng rfb của vi khuẩn
Samonella phân loài A, B và D và cho thấy gen rfbE là vùng gen đặc hiệu cho phân loài S. typhi [47]. Hirose K. và cộng sự (2002) đã sử dụng multiplex PCR khuếch đại có chọn lọc các gen tyv (rfbE), prt (rfbS), viaB, và gen Flic để xác định Salmonella enterica serovar typhi và paratyphi A đạt kết quả đặc hiệu 100% [37]. Kết quả các nghiên cứu cho thấy gen rfbE hoàn toàn có thể sử dụng để phát hiện S. typhi một cách đặc hiệu.
Gen nuc là gen mã hóa protein nuclease chịu nhiệt ở S. aureus. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận dạng loài Staphylococci
dương tính với coagulase bằng phướng pháp multiplex PCR. Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu quy trình multiplex PCR tác giả đã sử dụng trên 374 chủng tụ cầu mà trước đó đã được xác định mức độ loài bằng cách tiếp cận sử dụng trình tự hsp60, quy trình đã thành công trong việc phân biệt giữa S. aureus, S. hyicus, S. schleiferi, S. intermedius, S. pseudintermedius, và nhóm S. Delphini
A và B. Phương pháp có độ đặc hiệu 100% và là phương pháp nhanh chóng đơn giản, tiết kiệm chi phí [67]. Brakstad O. G. và cộng sự (1992) đã sử dụng gen
nuc làm gen chỉ thị trong phát hiện S. aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc
[25]. Wilson I. G. và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị để phát hiện S. aureus trong sữa nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu vàng [76]. Để phát hiện S. aureus hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử đều sử dụng vùng trình tự gen nuc
làm mục tiêu cho việc thiết kế mồi vì đây là vùng trình tự đặc biệt, vừa có tính bảo tồn, vừa mang tính đặc trưng cho loài. Do vậy, trong nghiên cứu này gen
nuc đã được chọn để thiết kế mồi cho phát hiện S. aureus.
Kết quả thiết kế thử nghiệm cặp mồi NucF-NucR đặc hiệu cho
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
độ biến tính Tm hoàn toàn tương đồng với cặp mồi BS1-BS2. Đồng thời kích thước sản phẩm PCR của hai cặp mồi này có sự chênh lệch nhau 176bp, điều này đảm bảo cho sự khuếch đại đồng đều ở cả hai cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR và sản phẩm khuếch đại của hai cặp mồi này hoàn toàn phân biệt được trên hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Vậy hai cặp mồi này thỏa mãn cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi
và S. aureus.
Sau khi thiết kế hai cặp mồi phát hiện nhanh S. typhi và S. aureus, cả hai cặp mồi này tiếp tục được thử nghiệm khả năng khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR sử dụng chủng vi khuẩn S. aureus chuẩn do Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và chủng S. typhi chuẩn do Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên cung cấp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5 %. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trong hình 3.1. dưới đây.
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Đường chạy 1 và 6: Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2 và 3: mẫu DNA khuôn của chủng Salmonella typhi; đường chạy 4 và 5: mẫu DNA khuôn của
chủng Staphylococcus aureus; đường chạy M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy ở đường chạy 2, 3, 4, 5 các băng DNA rõ nét, không xuất hiện băng phụ. Ở đường chạy số 2 và 3 sản phẩm
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PCR tương ứng với kích thước 615 bp phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại từ gen rfbE của S. typhi và tương ứng với kết quả đã được công bố ở các công trình nghiên cứu trước [37], [47], [54]. Ở đường chạy số 4 và 5 sản phẩm PCR tương ứng với kích thước 439 bp phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại gen nuc của S. aureus theo lý thuyết. Ở đường chạy số 1 và 6 kiểm chứng âm tính không hiện băng.
Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu cho
Staphylococcus aureus và thỏa mãn các điều kiện cho phản ứng multiplex PCR khi sử dụng phối hợp với cặp mồi BS1-BS2 được thiết kế trước đây [54].
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR