4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
3.2.2.Nghiên cứu nồng độ DNA tối thiểu của các phản ứng PCR đơn phát hiện riêng
hiện riêng rẽ Staphylococcus aureus và Salmonella typhi
Để xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR đơn phát hiện riêng rẽ
S. aureus và S. typhi, dung dịch DNA tổng số của các chủng S. aureus BK và S. typhi YD được lựa chọn để pha loãng ở các độ pha loãng khác nhau và cách nhau 10 lần. Dung dịch DNA tổng số của chủng S. typhi YD sau khi pha loãng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BS1-BS2 và dung dịch DNA tổng số của chủng S. aureus BK sau khi pha loãng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, nồng độ DNA tối thiểu cho phép phản ứng PCR phát hiện được chủng vi khuẩn nghiên cứu là nồng độ DNA thấp nhất vẫn cho phép hình thành sản phẩm PCR trên hình ảnh gel điện di có thể quan sát được bằng mắt thường [1]. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi BS1-BS2 và cặp mồi NucF-NucR được thể hiện trên hình 3.3 dưới đây.
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR (đường chạy 1-6) và sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi BS1-
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đường chạy 6 và 7: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 1, 2, 3, 4, 5: nồng động DNA khuôn của chủng S. aureus BK ở các nồng độ lần lượt 2,0.10-5 ng/ l; 2,0.10-4 ng/ l; 2,0.10-3 ng/ l; 2,0.10-2 ng/ l; 2,0.10-1 ng/ l; đường chạy 8,
9, 10, 11, 12 nồng độ DNA khuôn của chủng S. typhi YD ở các nồng độ lần lượt là 1,8 ng/ l; 1,8.10-1
ng/ l; 1,8.10-2 ng/ l; 1,8.10-3 ng/ l; 1,8.10-4 ng/ l; đường chạy M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Kết quả nghiên cứu thể hiện trên hình 3.3 cho thấy khi giảm dần nồng độ DNA khuôn trong phản ứng PCR, cường độ băng DNA trên hình ảnh điện di cũng giảm dần. Khi nồng độ DNA khuôn của S. aureus giảm đến 2,0.10-4 ng/µl thì sản phẩm PCR không xuất hiện ở đường chạy số 2. Điều đó chứng tỏ nồng độ DNA khuôn của S. aureus ở mức 2,0.10-4 ng/µl quá thấp không cho phép hình thành sản phẩm PCR có thể nhận thấy được bằng mắt thường trên bản điện di. Vậy nồng độ DNA khuôn tối thiểu của S. aureus trong phản ứng 25µl đối với cặp mồi NucF-NucR là 2,0.10-3
ng/µl. Đối với DNA khuôn của S. typhi
giảm đến 1,8.10-4
ng/µl thì sản phẩm PCR không xuất hiện trên ở đường chạy số 12. Ở nồng độ 1,8.10-4
ng/µl DNA khuôn của S. typhi quá thấp không cho phép hình thành sản phẩm PCR có thể nhận biết bằng mắt thường trên bản điện di. Vậy nồng độ DNA khuôn tối thiểu của S. typhi trong phản ứng 25µl đối với cặp mồi BS1-BS2 là 1,8.10-3
ng/µl. Từ kết quả nồng độ DNA khuôn tối thiểu của S. aureus và S. typhi để tối ưu phản ứng multiplex PCR sử dụng đồng thời 2 cặp mồi NucF-NucR và BS1-BS2, hàm lượng DNA khuôn được lựa chọn ở mức 2,0.10-2
ng/µl và 1,8.10-2 ng/µl trong mỗi phản ứng 25µl.
Theo các công bố đã nghiên cứu về nồng độ DNA khuôn tối thiểu cho phản ứng PCR như nghiên cứu của Mousavi S. L. và cộng sự (2006) trong việc phát hiện Salmonella typhi thì nồng độ khuôn DNA tối thiểu là 2,5.10-3
ng/ l [54], của Kumar S. và cộng sự (2005) có nồng độ DNA khuôn tối thiểu là 3.10-3ng/ l [44]. Như vậy nồng độ DNA khuôn tối thiểu của phản ứng PCR trong nghiên cứu này cũng tương đương với nghiên cứu của Mousavi S. L. và cộng sự năm 2006.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Để thực hiện tối ưu các điều kiện cho phản ứng multiplex PCR tiếp theo việc xác định nồng độ DNA khuôn tối thiểu của S. aureus và S. typhi là rất quan trọng. Nếu nồng độ DNA khuôn của S. aureus và S. typhi được sử dụng khi tối ưu các điều kiện của phản ứng multiplex PCR cao thì sự khác biệt của kết quả băng điện di khi tối ưu các điều kiện phản ứng sẽ không có sự khác biệt rõ ràng và khó nhận biết được sự khác nhau. Để thấy được sự khác nhau rõ ràng khi tối ưu các điều kiện phản ứng multiplex PCR, nồng độ DNA khuôn cung cấp cho phản ứng PCR phải thấp [1]. Do đó, để tối ưu các điều kiện cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi và Staphylococcus aureus
chúng tôi lựa chọn nồng độ DNA khuôn của S. aureus và S. typhi tương đương là 2,0.10-2 ng/µl và 1,8.10-2 ng/µl.