4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
3.2.5. Thử nghiệm quy trình kỹ thuật multiplexPCR với các phương pháp tách chiết
tách chiết DNA khác nhau
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi và S. aureus đã xây dựng tiếp tục được thử nghiệm với các phương pháp tách chiết DNA khác nhau. Để tiến hành thí nghiệm này, chủng vi khuẩn S. typhi và S. aureus được nuôi cấy trên môi trường lỏng đặc hiệu rồi được ly tâm thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch đệm TE 1x. Dịch huyền phù của chủng S. typhi và của chủng S. aureus trong dung dịch đệm TE 1x được trộn lẫn với nhau
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
rồi được chia đều thành 2 phần bằng nhau. Một phần dung dịch được tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phương pháp sử dụng hóa chất và phần dung dịch còn lại được tiến hành phá vỡ tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt như đã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu. Sản phẩm tách chiết DNA tổng số bằng hóa chất và dịch phá vỡ tế bào được sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại của phản ứng multiplex PCR được thể hiện trong hình 3.8 dưới đây.
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR khi sử dụng 2 phương pháp tách chiết DNA khác nhau.
Đường chạy 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy số 2 và 3: hỗn hợp DNA tổng số của S. typhi và S. aureus được tách chiết theo phương pháp sử dụng hóa chất; đường chạy 4 và 5: hỗn hợp S. typhi và S. aureus được phá vỡ
tế bào theo phương pháp sốc nhiệt.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, khi sử dụng hỗn hợp DNA tổng số được phá vỡ tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt thì hình ảnh điện di sản phẩm PCR có cường độ băng DNA thấp hơn so với hỗn hợp DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp hóa chất. Sự khác biệt về hiệu quả tách chiết DNA giữa 2 phương pháp trên được giải thích như sau: Trong phương pháp xử lý bằng sốc nhiệt, sự thay đổi nhiệt độ đột ngột làm cho cấu trúc thành tế bào vi khuẩn bị phá hủy mạnh từ đó thu được DNA, do chỉ được xử lý bằng sốc nhiệt nên khi lượng DNA thu được vẫn còn lẫn tạp chất nên hiệu quả khuếch đại của
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phản ứng PCR kém hơn. Trong khi đó sử dụng phương pháp tách chiết DNA bằng hóa chất, thành tế bào bị phá hủy mạnh hơn, các tạp chất tồn tại trong mẫu được loại bỏ bằng các hóa chất tiêu chuẩn chính điều đó làm cho hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR cao hơn. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu này có thể khẳng định phản ứng multiplex PCR được xây dựng trong nghiên cứu có thể sử dụng khuôn là DNA được tách chiết bằng phương pháp hóa chất và khuôn là dịch phá vỡ tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt. Theo Pui C. F. và cộng sự (2011) cho biết phương pháp tách chiết DNA có thể ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng multiplex PCR xác định tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm [63]. Tách chiết DNA cần được thực hiện nhanh chóng và đơn giản để giảm nguy cơ nhiễm chéo [52]. Phương pháp tách chiết bằng sốc nhiệt đơn giản hơn, nhanh hơn, chi phí thấp hơn so với phương pháp tách chiết hóa chất. Do đó phương pháp tách chiết bằng sốc nhiệt có khả năng làm giảm nguy cơ nhiễm chéo giữa các mẫu khi tiến hành trên một số lượng lớn mẫu.