4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
1.2.2.5. Đặc tính gây bệnh do Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens [14], [26], [57], [75]. Triệu chứng thường gặp ở các vụ ngộ độc do tụ cầu là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp. Triệu chứng ngộ độc xảy ra nhanh, từ 3-6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc tố cũng như sức khỏe của từng người [26]. Thường thì các triệu chứng chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, khoảng 6-8 giờ và hết bệnh sau 1-2 ngày [26]. Tuy nhiên khoảng 10% trường hợp người bệnh bị mất nhiều nước cần phải nhập viện để truyền dịch [57].
Những thực phẩm bị nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá, gà và sản phẩm từ chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên men [54], [57].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt. Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ rất lớn, từ 7o
C - 48oC. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít được chú ý [66].
Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh. Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence) của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ. Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô). Giống như các vi khuẩn Gram dương khác là Streptococcus và
Mycobacteria, S. aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Một khi đã bám dính vào bề mặt tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. Staphylococcus aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập [77]. Staphylococcus aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase, hemolysine, leukocidin, exfoliatine ,… phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [72].
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng tăng trưởng về số lượng. Ngoài nguyên nhân là do tụ cầu, một số trường hợp có thêm vai trò của vi khuẩn Clostridium difficile. Ước
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tính khoảng 0,1 mg S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [77].
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện Staphylococcus aureus và Salmonella typhi 1.3.1. Các phương pháp vi sinh
Hiện nay, phương pháp truyền thống để xét nghiệm Salmonella typhi và
Staphylococcus aureus trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn; quy trình này phải trải qua nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định các tính chất hóa sinh và miễn dịch [17], [37], [44], [54].
Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền.
Nhược điểm: Độ nhạy không cao [63], thời gian để xác định tình trạng ô nhiễm thực phẩm do Salmonella typhi và Staphylococcus aureus lâu, tốn nhiều nhân công cần có nhân viên có kỹ thuật có kinh nghiệm về vi sinh vật, không thể phát hiện được các chủng Salmonella typhi và Staphylococcus aureus này có sinh độc tố do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa, tốn nhiều hóa chất, yêu cầu kỹ năng thao tác.
Tụ cầu dương tính với coagulase không phải là S. aureus thường xuyên được xác định nhầm là S. aureus [67]. Rất khó để phát hiện các loài dựa trên sự khác biệt về kiểu hình bởi vì không có dấu hiệu phản ứng sinh hóa duy nhất (tiêu chuẩn vàng) nào đặc trưng cho nhận dạng các loài [67], [68].
Phƣơng pháp miễn dịch: dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.
Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ khoảng 10 pg. Thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống.
Nhược điểm: Phải có những cán bộ kinh nghiệm và được đào tạo bài bản mới có thể thực hiện được.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tuy vậy phương pháp miễn dịch vẫn cho tỉ lệ kết quả dương tính giả cao. Theo nghiên cứu của Berke A. và cộng sự (1986) cho biết tỉ lệ dương tính giả khi xác định Staphylococcus aureus bằng phương pháp miễn dịch là 10,3% và họ khuyến cáo sử dụng phương pháp miễn dịch như là biện pháp thông thường để xác định Staphylococcus aureus [21].
1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp truyền thống tuy được sử dụng từ rất lâu, được nhiều quốc gia công nhận nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như mất nhiều thời gian, công sức, tốn kém, thường phải mất khoảng 4-5 ngày mới xác định được mẫu có nhiễm vi sinh vật hay không [37], [44], [54]. Để khắc phục những nhược điểm này việc ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại để phát hiện và phân biệt các tác nhân gây bệnh ngày càng trở nên quan trọng hơn trong vệ sinh an toàn thực phẩm [14], [44].
Kỹ thuật PCR: Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai đoạn khác nhau của quá trình phản ứng: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài. Đây là kỹ thuật nhân số lượng bản sao gen của độc tố vi khuẩn trong thực phẩm lên hàng triệu lần đến mức có thể phát hiện được chúng.
Nhiều công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR để phát hiện S. typhi
và các phân loài Salmonella khác đã được công bố [13], [30], [36], [37], [56], [78].
Ưu điểm: Độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao. Thời gian thực hiện nhanh giúp cho công tác phòng ngừa. Đơn giản ít tốn kém.
Nhược điểm: Có thể xuất hiện hiện tượng dương tính giả nếu có hiện tượng nhiễm DNA đích trong không khí hoặc trong sinh phẩm, trong dụng cụ.
Kỹ thuật Realtime PCR: Phương pháp này cho phép theo dõi sự hình thành sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang từ đó định lượng nồng độ vi sinh vật trong thực phẩm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Năm 2007 Malorny B. và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật realtime PCR để phát hiện vi khuẩn Salmonella enteritidis trong thịt gia cầm và trứng. Gen
Prot6e nằm trên S. enteritidis đã được sử dụng để thiết kế mồi và mẫu dò. Độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình đạt 100% [49]. Munoz N. và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phát triển kỹ thuật multiplex realtime PCR để xác định loài
Salmonella enterica Serovars phổ biến có trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm. Trong nghiên cứu này các gen rfb, flic, fljB, và viaB đã được sử dụng để thiết kế 15 cặp mồi và các mẫu dò. Độ đặc hiệu và độ nhạy của quy trình lần lượt là 100% và 95,5% khi được đánh giá thông qua việc sử dụng 267 Salmonella mẫu được chọn ngẫu nhiên [55].
Ưu điểm: Nhanh, xác định chính xác lượng sản phẩm tạo ra tại mỗi thời điểm của phản ứng. Độ nhạy độ đặc hiệu cao. Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR.
Nhược điểm: Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là chi phí cao, yêu cầu thiết bị đắt tiền và yêu cầu cán bộ phân tích có kinh nghiệm, được đào tạo bài bản.
Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD- PCR): Phương pháp này lần đầu tiên được phát hiện bởi Williams và cộng sự năm 1990 trên cơ sở kỹ thuật PCR. Khác với kỹ thuật PCR thông thường sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các trình tự đã biết, RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9 đến 12 base. Như vậy, RAPD cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một trình tự nucleotide nhất định. Tính đa hình này có thể sử dụng làm chỉ thị phân tử hoặc dùng để lập bản đồ gen.
Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RAPD đã được công bố như Quintaes B. R. và cộng sự (2004) tối ưu hóa của phản ứng RAPD đặc trưng cho Salmonella enterica serovar typhi, trong nghiên cứu này để tối ưu phản ứng RAPD các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của DNA khuôn, mồi, MgCl2 và Taq polymerase để kiểm tra 8 chủng Salmonella typhi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Ưu điểm: Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân biệt các loài khác nhau.
Nhược điểm: Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng như
chất lượng DNA, nồng độ Mg2+
, tỷ lệ giữa mồi và đoạn mẫu vì thế các kết quả không phải luôn trước sau như một.
Kỹ thuật điện di xung trƣờng (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoreis): Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz và Cantor (1984) giới thiệu. Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một điện trường không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau. Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau của DNA phụ thuộc chủ yếu vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường [32], [40].
Stephen G. L. và cộng sự (2010) đã sử dụng phương pháp PFGE để giám sát sự tăng cường lây nhiễm của vi khuẩn Salmonella [69].
Ưu điểm: Tiêu chuẩn vàng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các vi khuẩn.
Nhược điểm: Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyện dụng, cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiểm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên một số đối tượng vi sinh vật.
1.4. Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Multiplex PCR là phản ứng PCR cho phép phát hiện cùng lúc nhiều gen của một sinh vật hay nhiều sinh vật khác nhau bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong một phản ứng [63].
Kỹ thuật này không khác nhiều so với kỹ thuật PCR thông thường. Điểm khác biệt duy nhất là thay vì sử dụng 1 cặp mồi để nhân lên 1 loại DNA hay gen đích ở PCR thông thường, multiplex PCR sử dụng từ 2, 3 hay 5 cặp mồi trở lên để nhân lên ít nhất là 2 loại DNA hay gen đích tại cùng một thời điểm và cùng một chế độ nhiệt của chu kỳ phản ứng PCR [33], [37], [63], [71].
Các đoạn DNA, gen được nhân lên đồng thời thường nhằm mục đích phát hiện cùng một lúc nhiều đối tượng (loài, chủng…) khác nhau hoặc sàng lọc các đối tượng gây bệnh có khả năng đồng nhiễm ở một loại mẫu bệnh phẩm (máu, nước tiểu, mô…). Vì thế, multiplex PCR giúp giảm thiểu các thao tác và tiết kiệm thời gian trong chẩn đoán, sàng lọc phát hiện bệnh [67].
1.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh vật gây bệnh
Mặc dù đã có nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau được áp dụng để phát hiện Staphylococcus aureus [19], [22], [24], [46], [62], [68] nhưng hầu hết các phương pháp đó đều tốn kém về kinh phí và thời gian, không những thế cách bố trí thí nghiệm và diễn giải kết quả rất phức tạp [67].
So với các kỹ thuật phát hiện nhanh và đồng thời tác nhân gây bệnh khác, kỹ thuật multiplex PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên đã trở thành công cụ phổ biến trong việc phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh trên người, vật nuôi cũng như trong các mẫu thực phẩm. Vì vậy chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu phương pháp multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời cả hai vi khuẩn S. typhi và S. aureus.
Từ các mô tả đầu tiên năm 1988, phương pháp multiplex PCR đã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA gồm có phân
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tích mất đoạn, đột biến, đa hình. Hiện nay kỹ thuật multiplex PCR đã được áp dụng để phát hiện các virút đồng nhiễm lây truyền qua đường máu như HIV, HPV, HCV, các loại ký sinh trùng gây bệnh sốt rét, các loại các vi khuẩn và nấm men gây bệnh phụ khoa, các vi khuẩn gây đường ruột ngộ độc thực phẩm. Việc phát hiện các vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật multilex PCR là một phương pháp đơn giản, hiệu quả, có thể được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật trong vòng chưa đầy 24 giờ sẽ cho kết quả chính xác thay vì 4 - 5 ngày bằng phương pháp nuôi cấy thông thường [44]. Freitas C. G. và cộng sự (2010) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh và trực tiếp sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella enteritidis, typhi
và typhimurium xuất hiện trong thịt gia cầm [33]. Taniuchi M. và cộng sự (2011) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện Cyclospora, Cystoisospora, và
Microsporidia trong mẫu phân. Tác giả đã sử dụng 4 cặp mồi để khuếch đại vùng gen mục tiêu trong Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora belli,
Enterocytozoon bieneusi và Encephalitozoon intestinalis. Kết quả cho thấy quy trình có độ đặc hiệu cao đạt 100% [71]. Pui C. F. và cộng sự (2011) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời vi khuẩn Salmonella spp,
Salmonella typhi và Salmonella typhimurium. Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình multiplex PCR có độ đặc hiệu cao cung cấp một phương pháp tiếp cận nhanh chóng và đáng tin cậy cho phép giám sát hiệu quả của các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh [63]. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng multiplex PCR để xác định loài Staphylococci dương tính với coagulase [67].
Ở Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh. Nguyễn Đỗ Phúc và cộng sự (2002) đã nghiên cứu xây dựng bộ kít multiplex PCR phát hiện đồng thời các tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm gồm Listeria monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhạy của bộ kít multiplex PCR khi phát hiện Listeria monocytogene, Vibrio cholerae và
Shigella spp là 103 vi khuẩn/ml và độ đặc hiệu của bộ kít multiplex PCR là đặc hiệu với các vi khuẩn đích Listeria monocytogene, Vibrio cholerae và Shigella
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/