4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị
Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Cân phân tích Sartorius TE214S, Đức
2 Lò vi sóng LG, Nhật Bản
3 Máy điện di Mupid 2 plus, Hàn Quốc
4 Máy PCR Kyratec, Úc
5 Máy Spindown Hanil, Hàn Quốc
6 Máy Vortex IKA ZX3, Italia
7 Máy ly tâm Hanil, Hàn Quốc
8 Nồi khử trùng ALP, Nhật Bản
9 Tủ an toàn sinh học Việt Nam
10 Tủ đông SANYO, Nhật Bản
11 Tủ sấy (700
C) Memment+, Đức
12 Micropipet các loại Gillson, Pháp
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Quy trình thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Stapylococcus aureus và Salmonella typhi được thực hiện theo các bước như sau:
Bước 1: Thu thập các trình tự gen nuc của các chủng S. aureus đã công bố trên ngân hàng gen (GeneBank) tại trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Bước 2: So sánh tất cả các trình tự gen nuc ở S. aureus thu thập được
bằng phần mềm ClustalW2 trực tuyến trên trang web
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ để tìm các vùng tương đồng ở tất cả các trình tự gen nuc thu thập được.
Bước 3: Lựa chọn vùng trình tự tương đồng ở tất cả các trình tự gen nuc
để thiết kế thử các cặp mồi (cả mồi xuôi và mồi ngược).
Bước 4: Kiểm tra giá trị Tm của các cặp mồi được thiết kế thử trực tuyến tại trang web http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm.
Bước 5: Kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi thiết kế thử bằng chương trình Blast trực tuyến tại trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Bước 6: Thử nghiệm khả năng hình thành cấu trúc bậc 2 của các mồi do sự tự bắt cặp của mồi, sự bắt cặp chéo giữa mồi xuôi và mồi ngược, sự bắt cặp chéo giữa các cặp mồi của phản ứng multiplex PCR bằng phần mềm Vector NTI 11.0 (Invitrogen). Nếu cặp mồi phù hợp sẽ sử dụng, nếu có hiện tượng hình thành cấu trúc bậc 2 của mồi sẽ tiến hành thử nghiệm lại từ bước 3.
Bước 7: Thử nghiệm khả năng khuếch đại vùng gen mục tiêu của phản ứng PCR sử dụng DNA khuôn của chủng vi khuẩn kiểm định.
2.4.1.2. Thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng bằng phản ứng PCR ứng PCR
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu được thử nghiệm khả năng khuếch đại vùng DNA khuôn bằng phản ứng PCR như sau:
- Thành phần phản ứng: + 10x PCR buffer: 2,5 µl + MgCl2 (25 mM): 1,5 µl + dNTPs (2,5 mM): 1,5 µl + Mồi xuôi (10 µM): 1,5 µl + Mồi ngược (10 µM): 1,5 µl
+ Taq DNA polymerase (5U/µl): 0,2 µl
+ DNA khuôn: 2,5 µl
+ H2O 13,8 µl
- Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn sau: + Giai đoạn biến tính ban đầu ở 95o
C trong 5 phút
+ Giai đoạn khuếch đại: 30 chu kỳ bao gồm các bước sau: Biến tính: 95o
C trong 30 giây
Gắn mồi: 53o
C trong 45 giây
Kéo dài mồi: 72oC trong 45 giây
+ Giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72o
C trong 5 phút
+ Giai đoạn ủ bảo quản: cho đến khi lấy sản phẩm PCR
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TAE 0,5x ở hiệu điện thế 100V trong 30-40 phút.
2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được phá vỡ nhanh bằng sốc nhiệt theo phương pháp của Nguyễn Văn Duy (2011) [1], như sau:
Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nghiên cứu đã nuôi qua đêm vào eppendorf 2,0 ml. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ dịch nổi. Bổ sung 100 µl dung dịch đệm TE 1x, đảo trộn đều.
Bước 2: Ủ ở 95oC trong 10 phút, đảo trộn mạnh bằng máy vortex. Bước 3: Ủ ở -20o
C trong 10 phút.
Bước 4: Lặp lại bước 2 đến bước 3 hai lần nữa.
Dung dịch phá vỡ tế bào được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu.
2.4.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn bằng hóa chất
DNA của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được tách chiết bằng hóa chất theo phương pháp của Trần Thị Xuân Mai và cộng sự (2011) [7] với một chút biến đổi nhỏ. Cụ thể các bước như sau:
- Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nghiên cứu đã nuôi qua đêm vào eppendorf 2,0 ml. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu cặn tế bào. Lặp lại 3 lần.
- Hòa tan cặn tế bào trong 700 µl đệm CTAB.
- Ủ ở 60º C trong 1h, cứ 10 phút tiến hành đảo trộn mạnh 1 lần bằng máy vortex.
- Bổ sung 700 ml CIAA, đảo trộn đều bằng cách lắc ống eppendorf, ly tâm 10 000 rpm trong 10 phút.
- Chuyển 600 µl dung dịch pha trên sang ống eppendorf mới, bổ sung 50µl CH3COONa 3M (pH 5,5) và 500µl isopropanol, đảo trộn đều.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Ly tâm 10 000 rpm trong 30 phút.
- Loại bỏ dịch nổi.
- Rửa tủa bằng cồn 70%.
- Để bay hơi hết cồn trong điều kiện phòng.
- Hòa tan tủa bằng 50 µl TE 1x.
- Ủ trong 70º C trong 10 phút.
- Bảo quản mẫu ở -20º C.
2.4.2.3. Định lượng, kiểm tra chất lượng tách chiết DNA
* Pha loãng mẫu DNA:
Pha loãng bậc 10 huyền dịch vi khuẩn đã tách chiết để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là : 10-1
; 10-2 ; 10-3 ; 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7…
- Lấy 100µl huyền dịch vi khuẩn cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 900µl nước khử ion vô trùng, trộn ñều bằng máy trộn vortex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-1
.
- Lấy 100µl huyền dịch có độ pha loãng vi khuẩn là 10-1 sang eppendorf 1,5 ml có chứa 900µl nước khử ion vô trùng, trộn đều bằng máy trộn vortex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-2
.
Tiếp tục pha loãng như vậy ta sẽ có được nồng độ pha loãng vi khuẩn từ huyền dịch ban đầu là… 10-4
; 10-5 ; 10-6 và 10-7.
* Định lượng và kiểm tra chất lượng tách chiết DNA:
DNA tổng số được kiểm tra độ tinh sạch và được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm và 280 nm [7].
Nồng độ DNA được tính toán theo công thức sau: CDNA (ng/µl) = OD260 x 50 x độ pha loãng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trong đó: CDNA là nồng độ DNA sợi đôi trong dung dịch OD260 là hệ số phấp phụ ở bước sóng 260 nm
Dung dịch DNA đủ độ tinh sạch cho các phân tích sinh học phân tử khi hệ số OD260/ OD280 = 1,8-2,0 (trong đó OD280 là hệ số hấp phụ ở bước sóng 280 nm).
2.4.3. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi aureus và Salmonella typhi
Phát hiện đồng thời tụ cầu vàng S. aureus và vi khuẩn thương hàn S. typhi bằng phản ứng multiplex PCR như sau:
- Thành phần phản ứng PCR: + 10x PCR buffer: 2,5 µl + MgCl2 (25 mM): 1,5 µl + dNTPs (2,5 mM): 3,0 µl + Mồi BS1 (10 µM): 1,0 µl + Mồi BS2 (10 µM): 1,0 µl + Mồi NucF (10 µM): 2,0 µl + Mồi NucR (10 µM): 2,0 µl
+ Taq DNA polymerase (5U/µl): 0,2 µl
+ DNA khuôn: 2,5 µl
+ H2O 9,3 µl
- Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn sau:
+ Giai đoạn biến tính ban đầu ở 95o
C trong 5 phút.
+ Giai đoạn khuếch đại: 30 chu kỳ bao gồm các bước sau Biến tính: 95o
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Gắn mồi: 55o
C trong 45 giây
Kéo dài mồi: 72oC trong 60 giây
+ Giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72o
C trong 5 phút
+ Giai đoạn ủ bảo quản: cho đến khi lấy sản phẩm PCR
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TAE 0,5x ở hiệu điện thế 100V trong 30-40 phút.
2.4.4. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR
Pha loãng bậc 10 dịch DNA tách chiết từ vi khuẩn nghiên cứu để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là : 10-1
; 10-2 ; 10-3 ; 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7… Dung dịch DNA ở các độ pha loãng khác nhau được sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR như đã trình bày.
Ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR được xác định là nồng độ DNA thấp nhất vẫn cho phép hình thành băng sản phẩm PCR trên hình ảnh điện di có thể quan sát được bằng mắt thường.
2.4.5. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của multiplex PCR
Để xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. aureus và S. typhi, phản ứng multiplex PCR được kiểm tra với khuôn là các chủng vi khuẩn S. aureus, S. typhi và các chủng vi khuẩn kiểm định bao gồm: Staphylococcus capitis, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Clostridium perfringens, Vibrio choleare, Listeria monocytogons, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium botulinum, Shigella spp. Độ đặc hiệu của phản ứng được đánh giá bằng sự hình thành phản ứng PCR với kích thước phù hợp khi sử dụng khuôn là DNA của các chủng S. aureus và S. typhi và không hình thành sản phẩm PCR khi sử dụng khuôn là DNA của các chủng vi khuẩn kiểm định.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. Thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi
Để phát hiện nhanh Salmonella typhi bằng phản ứng PCR, chúng tôi sử dụng cặp mồi đã được công bố trước đây bởi Mousavi S. L. và cộng sự năm 2006 [54]. Do đó, để phát hiện nhanh và đồng thời cả Salmonella typhi và Staphylococcus aureus, nhiệm vụ tiếp theo của đề tài này là thiết kế được cặp mồi đặc hiệu cho S. aureus đồng thời thỏa mãn được các điều kiện của phản ứng multiplex PCR. Dựa trên các công bố trước đây, gen mã hóa cho enzyme nuclease chịu nhiệt (nuc) đã được lựa chọn để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho S. aureus.
Gen rfbE là gen mã hóa protein vận chuyển màng CDP-tyvelose epimerase ở S. typhi. Nhiều công trình trên thế giới đã được công bố sử dụng gen rfbE làm chỉ thị để phát hiện S. typhi. Mousavi S. L. và cộng sự (2006) đã sử dụng gen
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
rfbE làm gen chỉ thị để phát hiện S. typhi bằng phương pháp PCR-ELISA, cặp mồi BS1 và BS2 đã được sử dụng để khuếch đại gen rfbE , kết quả của nghiên cứu cho thấy quy trình có độ đặc hiệu đạt 100%, giới hạn phát hiện trong PCR- ELISA là 2,5ρg DNA, toàn bộ quy trình mất khoảng 100 phút [54]. Liu D. và cộng sự (1991) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa các vùng rfb của vi khuẩn
Samonella phân loài A, B và D và cho thấy gen rfbE là vùng gen đặc hiệu cho phân loài S. typhi [47]. Hirose K. và cộng sự (2002) đã sử dụng multiplex PCR khuếch đại có chọn lọc các gen tyv (rfbE), prt (rfbS), viaB, và gen Flic để xác định Salmonella enterica serovar typhi và paratyphi A đạt kết quả đặc hiệu 100% [37]. Kết quả các nghiên cứu cho thấy gen rfbE hoàn toàn có thể sử dụng để phát hiện S. typhi một cách đặc hiệu.
Gen nuc là gen mã hóa protein nuclease chịu nhiệt ở S. aureus. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận dạng loài Staphylococci
dương tính với coagulase bằng phướng pháp multiplex PCR. Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu quy trình multiplex PCR tác giả đã sử dụng trên 374 chủng tụ cầu mà trước đó đã được xác định mức độ loài bằng cách tiếp cận sử dụng trình tự hsp60, quy trình đã thành công trong việc phân biệt giữa S. aureus, S. hyicus, S. schleiferi, S. intermedius, S. pseudintermedius, và nhóm S. Delphini
A và B. Phương pháp có độ đặc hiệu 100% và là phương pháp nhanh chóng đơn giản, tiết kiệm chi phí [67]. Brakstad O. G. và cộng sự (1992) đã sử dụng gen
nuc làm gen chỉ thị trong phát hiện S. aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc
[25]. Wilson I. G. và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm gen chỉ thị để phát hiện S. aureus trong sữa nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu vàng [76]. Để phát hiện S. aureus hầu hết các kỹ thuật sinh học phân tử đều sử dụng vùng trình tự gen nuc
làm mục tiêu cho việc thiết kế mồi vì đây là vùng trình tự đặc biệt, vừa có tính bảo tồn, vừa mang tính đặc trưng cho loài. Do vậy, trong nghiên cứu này gen
nuc đã được chọn để thiết kế mồi cho phát hiện S. aureus.
Kết quả thiết kế thử nghiệm cặp mồi NucF-NucR đặc hiệu cho
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
độ biến tính Tm hoàn toàn tương đồng với cặp mồi BS1-BS2. Đồng thời kích thước sản phẩm PCR của hai cặp mồi này có sự chênh lệch nhau 176bp, điều này đảm bảo cho sự khuếch đại đồng đều ở cả hai cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR và sản phẩm khuếch đại của hai cặp mồi này hoàn toàn phân biệt được trên hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Vậy hai cặp mồi này thỏa mãn cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. typhi
và S. aureus.
Sau khi thiết kế hai cặp mồi phát hiện nhanh S. typhi và S. aureus, cả hai cặp mồi này tiếp tục được thử nghiệm khả năng khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR sử dụng chủng vi khuẩn S. aureus chuẩn do Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và chủng S. typhi chuẩn do Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên cung cấp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5 %. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trong hình 3.1. dưới đây.
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Đường chạy 1 và 6: Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2 và 3: mẫu DNA khuôn của chủng Salmonella typhi; đường chạy 4 và 5: mẫu DNA khuôn của
chủng Staphylococcus aureus; đường chạy M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy ở đường chạy 2, 3, 4, 5 các băng DNA rõ nét, không xuất hiện băng phụ. Ở đường chạy số 2 và 3 sản phẩm
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PCR tương ứng với kích thước 615 bp phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại từ gen rfbE của S. typhi và tương ứng với kết quả đã được công bố ở các công trình nghiên cứu trước [37], [47], [54]. Ở đường chạy số 4 và 5 sản phẩm PCR tương ứng với kích thước 439 bp phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại gen nuc của S. aureus theo lý thuyết. Ở đường chạy số 1 và 6 kiểm chứng âm tính không hiện băng.
Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu cho
Staphylococcus aureus và thỏa mãn các điều kiện cho phản ứng multiplex PCR khi sử dụng phối hợp với cặp mồi BS1-BS2 được thiết kế trước đây [54].
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR aureus và Salmonella typhi bằng phản ứng multiplex PCR
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn
Trong nghiên cứu này, DNA tổng số của các chủng tụ cầu vàng (S. aureus) và vi khuẩn thương hàn (S. typhi) được tách chiết bằng phương pháp sử dụng hóa chất theo các công bố trước đây. Sản phẩm DNA tổng số được