4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
1.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp truyền thống tuy được sử dụng từ rất lâu, được nhiều quốc gia công nhận nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như mất nhiều thời gian, công sức, tốn kém, thường phải mất khoảng 4-5 ngày mới xác định được mẫu có nhiễm vi sinh vật hay không [37], [44], [54]. Để khắc phục những nhược điểm này việc ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại để phát hiện và phân biệt các tác nhân gây bệnh ngày càng trở nên quan trọng hơn trong vệ sinh an toàn thực phẩm [14], [44].
Kỹ thuật PCR: Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai đoạn khác nhau của quá trình phản ứng: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài. Đây là kỹ thuật nhân số lượng bản sao gen của độc tố vi khuẩn trong thực phẩm lên hàng triệu lần đến mức có thể phát hiện được chúng.
Nhiều công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR để phát hiện S. typhi
và các phân loài Salmonella khác đã được công bố [13], [30], [36], [37], [56], [78].
Ưu điểm: Độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao. Thời gian thực hiện nhanh giúp cho công tác phòng ngừa. Đơn giản ít tốn kém.
Nhược điểm: Có thể xuất hiện hiện tượng dương tính giả nếu có hiện tượng nhiễm DNA đích trong không khí hoặc trong sinh phẩm, trong dụng cụ.
Kỹ thuật Realtime PCR: Phương pháp này cho phép theo dõi sự hình thành sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang từ đó định lượng nồng độ vi sinh vật trong thực phẩm.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Năm 2007 Malorny B. và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật realtime PCR để phát hiện vi khuẩn Salmonella enteritidis trong thịt gia cầm và trứng. Gen
Prot6e nằm trên S. enteritidis đã được sử dụng để thiết kế mồi và mẫu dò. Độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình đạt 100% [49]. Munoz N. và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phát triển kỹ thuật multiplex realtime PCR để xác định loài
Salmonella enterica Serovars phổ biến có trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm. Trong nghiên cứu này các gen rfb, flic, fljB, và viaB đã được sử dụng để thiết kế 15 cặp mồi và các mẫu dò. Độ đặc hiệu và độ nhạy của quy trình lần lượt là 100% và 95,5% khi được đánh giá thông qua việc sử dụng 267 Salmonella mẫu được chọn ngẫu nhiên [55].
Ưu điểm: Nhanh, xác định chính xác lượng sản phẩm tạo ra tại mỗi thời điểm của phản ứng. Độ nhạy độ đặc hiệu cao. Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR.
Nhược điểm: Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là chi phí cao, yêu cầu thiết bị đắt tiền và yêu cầu cán bộ phân tích có kinh nghiệm, được đào tạo bài bản.
Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD- PCR): Phương pháp này lần đầu tiên được phát hiện bởi Williams và cộng sự năm 1990 trên cơ sở kỹ thuật PCR. Khác với kỹ thuật PCR thông thường sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các trình tự đã biết, RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9 đến 12 base. Như vậy, RAPD cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một trình tự nucleotide nhất định. Tính đa hình này có thể sử dụng làm chỉ thị phân tử hoặc dùng để lập bản đồ gen.
Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RAPD đã được công bố như Quintaes B. R. và cộng sự (2004) tối ưu hóa của phản ứng RAPD đặc trưng cho Salmonella enterica serovar typhi, trong nghiên cứu này để tối ưu phản ứng RAPD các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của DNA khuôn, mồi, MgCl2 và Taq polymerase để kiểm tra 8 chủng Salmonella typhi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Ưu điểm: Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân biệt các loài khác nhau.
Nhược điểm: Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng như
chất lượng DNA, nồng độ Mg2+
, tỷ lệ giữa mồi và đoạn mẫu vì thế các kết quả không phải luôn trước sau như một.
Kỹ thuật điện di xung trƣờng (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoreis): Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz và Cantor (1984) giới thiệu. Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một điện trường không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau. Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau của DNA phụ thuộc chủ yếu vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường [32], [40].
Stephen G. L. và cộng sự (2010) đã sử dụng phương pháp PFGE để giám sát sự tăng cường lây nhiễm của vi khuẩn Salmonella [69].
Ưu điểm: Tiêu chuẩn vàng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các vi khuẩn.
Nhược điểm: Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyện dụng, cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiểm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên một số đối tượng vi sinh vật.
