4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
1.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật multiplexPCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây
vật gây bệnh
Mặc dù đã có nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau được áp dụng để phát hiện Staphylococcus aureus [19], [22], [24], [46], [62], [68] nhưng hầu hết các phương pháp đó đều tốn kém về kinh phí và thời gian, không những thế cách bố trí thí nghiệm và diễn giải kết quả rất phức tạp [67].
So với các kỹ thuật phát hiện nhanh và đồng thời tác nhân gây bệnh khác, kỹ thuật multiplex PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên đã trở thành công cụ phổ biến trong việc phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh trên người, vật nuôi cũng như trong các mẫu thực phẩm. Vì vậy chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu phương pháp multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời cả hai vi khuẩn S. typhi và S. aureus.
Từ các mô tả đầu tiên năm 1988, phương pháp multiplex PCR đã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA gồm có phân
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tích mất đoạn, đột biến, đa hình. Hiện nay kỹ thuật multiplex PCR đã được áp dụng để phát hiện các virút đồng nhiễm lây truyền qua đường máu như HIV, HPV, HCV, các loại ký sinh trùng gây bệnh sốt rét, các loại các vi khuẩn và nấm men gây bệnh phụ khoa, các vi khuẩn gây đường ruột ngộ độc thực phẩm. Việc phát hiện các vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật multilex PCR là một phương pháp đơn giản, hiệu quả, có thể được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật trong vòng chưa đầy 24 giờ sẽ cho kết quả chính xác thay vì 4 - 5 ngày bằng phương pháp nuôi cấy thông thường [44]. Freitas C. G. và cộng sự (2010) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh và trực tiếp sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella enteritidis, typhi
và typhimurium xuất hiện trong thịt gia cầm [33]. Taniuchi M. và cộng sự (2011) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện Cyclospora, Cystoisospora, và
Microsporidia trong mẫu phân. Tác giả đã sử dụng 4 cặp mồi để khuếch đại vùng gen mục tiêu trong Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora belli,
Enterocytozoon bieneusi và Encephalitozoon intestinalis. Kết quả cho thấy quy trình có độ đặc hiệu cao đạt 100% [71]. Pui C. F. và cộng sự (2011) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời vi khuẩn Salmonella spp,
Salmonella typhi và Salmonella typhimurium. Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình multiplex PCR có độ đặc hiệu cao cung cấp một phương pháp tiếp cận nhanh chóng và đáng tin cậy cho phép giám sát hiệu quả của các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh [63]. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng multiplex PCR để xác định loài Staphylococci dương tính với coagulase [67].
Ở Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh. Nguyễn Đỗ Phúc và cộng sự (2002) đã nghiên cứu xây dựng bộ kít multiplex PCR phát hiện đồng thời các tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm gồm Listeria monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhạy của bộ kít multiplex PCR khi phát hiện Listeria monocytogene, Vibrio cholerae và
Shigella spp là 103 vi khuẩn/ml và độ đặc hiệu của bộ kít multiplex PCR là đặc hiệu với các vi khuẩn đích Listeria monocytogene, Vibrio cholerae và Shigella
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
spp và không đặc hiệu đối với các vi khuẩn: Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio parahamolyticus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E. coli [8]. Nguyễn Vũ Trung (2009) đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Salmonella và V. cholerae
trong bệnh phẩm tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu cho thấy độ đặc hiệu của của kỹ thuật multiplex PCR đạt 100% và giới hạn phát hiện của kỹ thuật này là 106
CFU/ml. Toàn bộ quy trình chỉ mất khoảng 6h kể cả thời gian chạy PCR, điện di [11]. Trần Thị Xuân Mai và cộng sự (2011) đã sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện nhanh Salmonella spp, Salmonella enterica hiện diện trong thực phẩm. Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng cặp mồi invA đặc hiệu cho Salmonella spp, và cặp mồi spvC đặc hiệu cho Salmonella enteritica bao gồm Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis làm gen chỉ thị. Quy trình này đã được thử nghiệm trên 260 mẫu thực phẩm thu thập tại các chợ khác nhau trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Kết quả đã xác định được tỷ lệ thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp là nem chua (20%), thịt heo (47,5%), thịt bò (30%), thịt gà (46,7%), trứng gà (lòng trắng và lòng đỏ) (10%), vỏ trứng gà (40%), chả lụa (10%), ba khía (0%), sò huyết (40%), bì heo (20%). Trong đó, 2,5% ở thịt heo, 2,5% ở thịt bò, 1,6% ở thịt gà, 10% ở vỏ trứng gà và 5% ở sò huyết phát hiện nhiễm Salmonella enteritica [7].
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguồn vi sinh vật:
- Các chủng vi khuẩn Salmonella typhi và Staphylococcus aureus do Viện CNSH&CNTP, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; Khoa Y học Cơ sở, Trường Đại học Y-Dược Thái Nguyên, Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên và Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp.
- Các chủng vi sinh vật kiểm định: Staphylococcus capitis, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Clostridium perfringens, Vibrio choleare, Listeria monocytogons, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium botulinum, Shigella spp do Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên cung cấp.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng6/2012 đến tháng 8/2013.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài
Đề tài nghiên cứu này sử dụng 2 cặp mồi bao gồm cặp mồi NucF-NucR đặc hiệu cho gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt ở S. aureus và cặp mồi BS1- BS2 đặc hiệu cho gen rfbE mã hóa cho protein vận chuyển màng CDP-tyvelose
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
epimerase ở S. typhi. Trong đó, các mồi BS1 và BS2 được sử dụng theo công bố của Mousavi S. L. và cộng sự năm 2006 [54], các mồi NucF và NucR do đề tài tự thiết kế. Trình tự mồi được đặt sản xuất tại công ty Intergrated DNA Technologies của Mỹ (www.IDTDNA.com). Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu này được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Gen mục tiêu Tên mồi Trình tự nucleotide (5’→3’) % GC Tm ( o C) Kích thước sản phẩm PCR (bp) rfbE BS1 GAGGAAGGGAAATGAAGCTTTT 40,9 54 615 BS2 TAGCAAACTGTCTCCCACCATAC 47,8 57
nuc NucF TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA 40,9 54 439
NucR GCCACGTCCATATTTATCAGTTC 43,5 54
Ghi chú:
- Cặp mồi BS1-BS2 được sử dụng theo công bố của Mousavi S. L. năm 2006 [54]
- Cặp mồi NucF-NucR: do đề tài tự thiết kế.
2.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài
Đề tài nghiên cứu sử dụng các hóa chất được thống kê dưới bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
1 CTAB Sigma, Đức
2 Chloroform Sigma, Đức
3 Isoamyl ahcohol Sigma, Đức
4 Isopropanol Sigma, Đức
5 CH3COONa 3M (pH= 5,5) Sigma, Đức
6 Ethanol Sigma, Đức
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
8 Agarose Sigma, Đức
9 Ethidium bromide Sigma, Đức
10 PCR buffer Fermentas, Đức
11 dATP, dGTP, dCTP, dTTP Fermentas, Đức
12 Taq DNA polymerase Fermentas, Đức
13 Primer Fermentas, Đức
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị
Đề tài nghiên cứu sử dụng các thiết bị được thống kê dưới bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Cân phân tích Sartorius TE214S, Đức
2 Lò vi sóng LG, Nhật Bản
3 Máy điện di Mupid 2 plus, Hàn Quốc
4 Máy PCR Kyratec, Úc
5 Máy Spindown Hanil, Hàn Quốc
6 Máy Vortex IKA ZX3, Italia
7 Máy ly tâm Hanil, Hàn Quốc
8 Nồi khử trùng ALP, Nhật Bản
9 Tủ an toàn sinh học Việt Nam
10 Tủ đông SANYO, Nhật Bản
11 Tủ sấy (700
C) Memment+, Đức
12 Micropipet các loại Gillson, Pháp
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Quy trình thiết kế cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Stapylococcus aureus và Salmonella typhi được thực hiện theo các bước như sau:
Bước 1: Thu thập các trình tự gen nuc của các chủng S. aureus đã công bố trên ngân hàng gen (GeneBank) tại trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Bước 2: So sánh tất cả các trình tự gen nuc ở S. aureus thu thập được
bằng phần mềm ClustalW2 trực tuyến trên trang web
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ để tìm các vùng tương đồng ở tất cả các trình tự gen nuc thu thập được.
Bước 3: Lựa chọn vùng trình tự tương đồng ở tất cả các trình tự gen nuc
để thiết kế thử các cặp mồi (cả mồi xuôi và mồi ngược).
Bước 4: Kiểm tra giá trị Tm của các cặp mồi được thiết kế thử trực tuyến tại trang web http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm.
Bước 5: Kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi thiết kế thử bằng chương trình Blast trực tuyến tại trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Bước 6: Thử nghiệm khả năng hình thành cấu trúc bậc 2 của các mồi do sự tự bắt cặp của mồi, sự bắt cặp chéo giữa mồi xuôi và mồi ngược, sự bắt cặp chéo giữa các cặp mồi của phản ứng multiplex PCR bằng phần mềm Vector NTI 11.0 (Invitrogen). Nếu cặp mồi phù hợp sẽ sử dụng, nếu có hiện tượng hình thành cấu trúc bậc 2 của mồi sẽ tiến hành thử nghiệm lại từ bước 3.
Bước 7: Thử nghiệm khả năng khuếch đại vùng gen mục tiêu của phản ứng PCR sử dụng DNA khuôn của chủng vi khuẩn kiểm định.
2.4.1.2. Thử nghiệm khả năng khuếch đại của các cặp mồi sử dụng bằng phản ứng PCR ứng PCR
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu được thử nghiệm khả năng khuếch đại vùng DNA khuôn bằng phản ứng PCR như sau:
- Thành phần phản ứng: + 10x PCR buffer: 2,5 µl + MgCl2 (25 mM): 1,5 µl + dNTPs (2,5 mM): 1,5 µl + Mồi xuôi (10 µM): 1,5 µl + Mồi ngược (10 µM): 1,5 µl
+ Taq DNA polymerase (5U/µl): 0,2 µl
+ DNA khuôn: 2,5 µl
+ H2O 13,8 µl
- Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn sau: + Giai đoạn biến tính ban đầu ở 95o
C trong 5 phút
+ Giai đoạn khuếch đại: 30 chu kỳ bao gồm các bước sau: Biến tính: 95o
C trong 30 giây
Gắn mồi: 53o
C trong 45 giây
Kéo dài mồi: 72oC trong 45 giây
+ Giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72o
C trong 5 phút
+ Giai đoạn ủ bảo quản: cho đến khi lấy sản phẩm PCR
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TAE 0,5x ở hiệu điện thế 100V trong 30-40 phút.
2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được phá vỡ nhanh bằng sốc nhiệt theo phương pháp của Nguyễn Văn Duy (2011) [1], như sau:
Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nghiên cứu đã nuôi qua đêm vào eppendorf 2,0 ml. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ dịch nổi. Bổ sung 100 µl dung dịch đệm TE 1x, đảo trộn đều.
Bước 2: Ủ ở 95oC trong 10 phút, đảo trộn mạnh bằng máy vortex. Bước 3: Ủ ở -20o
C trong 10 phút.
Bước 4: Lặp lại bước 2 đến bước 3 hai lần nữa.
Dung dịch phá vỡ tế bào được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu.
2.4.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn bằng hóa chất
DNA của các chủng vi khuẩn nghiên cứu được tách chiết bằng hóa chất theo phương pháp của Trần Thị Xuân Mai và cộng sự (2011) [7] với một chút biến đổi nhỏ. Cụ thể các bước như sau:
- Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nghiên cứu đã nuôi qua đêm vào eppendorf 2,0 ml. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu cặn tế bào. Lặp lại 3 lần.
- Hòa tan cặn tế bào trong 700 µl đệm CTAB.
- Ủ ở 60º C trong 1h, cứ 10 phút tiến hành đảo trộn mạnh 1 lần bằng máy vortex.
- Bổ sung 700 ml CIAA, đảo trộn đều bằng cách lắc ống eppendorf, ly tâm 10 000 rpm trong 10 phút.
- Chuyển 600 µl dung dịch pha trên sang ống eppendorf mới, bổ sung 50µl CH3COONa 3M (pH 5,5) và 500µl isopropanol, đảo trộn đều.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Ly tâm 10 000 rpm trong 30 phút.
- Loại bỏ dịch nổi.
- Rửa tủa bằng cồn 70%.
- Để bay hơi hết cồn trong điều kiện phòng.
- Hòa tan tủa bằng 50 µl TE 1x.
- Ủ trong 70º C trong 10 phút.
- Bảo quản mẫu ở -20º C.
2.4.2.3. Định lượng, kiểm tra chất lượng tách chiết DNA
* Pha loãng mẫu DNA:
Pha loãng bậc 10 huyền dịch vi khuẩn đã tách chiết để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là : 10-1
; 10-2 ; 10-3 ; 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7…
- Lấy 100µl huyền dịch vi khuẩn cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 900µl nước khử ion vô trùng, trộn ñều bằng máy trộn vortex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-1
.
- Lấy 100µl huyền dịch có độ pha loãng vi khuẩn là 10-1 sang eppendorf 1,5 ml có chứa 900µl nước khử ion vô trùng, trộn đều bằng máy trộn vortex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-2
.
Tiếp tục pha loãng như vậy ta sẽ có được nồng độ pha loãng vi khuẩn từ huyền dịch ban đầu là… 10-4
; 10-5 ; 10-6 và 10-7.
* Định lượng và kiểm tra chất lượng tách chiết DNA:
DNA tổng số được kiểm tra độ tinh sạch và được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm và 280 nm [7].
Nồng độ DNA được tính toán theo công thức sau: CDNA (ng/µl) = OD260 x 50 x độ pha loãng
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trong đó: CDNA là nồng độ DNA sợi đôi trong dung dịch OD260 là hệ số phấp phụ ở bước sóng 260 nm
Dung dịch DNA đủ độ tinh sạch cho các phân tích sinh học phân tử khi hệ số OD260/ OD280 = 1,8-2,0 (trong đó OD280 là hệ số hấp phụ ở bước sóng 280 nm).
2.4.3. Phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Salmonella typhi aureus và Salmonella typhi
Phát hiện đồng thời tụ cầu vàng S. aureus và vi khuẩn thương hàn S. typhi bằng phản ứng multiplex PCR như sau:
- Thành phần phản ứng PCR: + 10x PCR buffer: 2,5 µl + MgCl2 (25 mM): 1,5 µl + dNTPs (2,5 mM): 3,0 µl + Mồi BS1 (10 µM): 1,0 µl + Mồi BS2 (10 µM): 1,0 µl + Mồi NucF (10 µM): 2,0 µl + Mồi NucR (10 µM): 2,0 µl
+ Taq DNA polymerase (5U/µl): 0,2 µl
+ DNA khuôn: 2,5 µl
+ H2O 9,3 µl
- Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn sau:
+ Giai đoạn biến tính ban đầu ở 95o
C trong 5 phút.
+ Giai đoạn khuếch đại: 30 chu kỳ bao gồm các bước sau Biến tính: 95o
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Gắn mồi: 55o
C trong 45 giây
Kéo dài mồi: 72oC trong 60 giây
+ Giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72o
C trong 5 phút
+ Giai đoạn ủ bảo quản: cho đến khi lấy sản phẩm PCR
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TAE 0,5x ở hiệu điện thế 100V trong 30-40 phút.
2.4.4. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR
Pha loãng bậc 10 dịch DNA tách chiết từ vi khuẩn nghiên cứu để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là : 10-1
; 10-2 ; 10-3 ; 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7…