Western Blotting là phương pháp phát hiện protein mục tiêu trong phức hợp protein sau khi chuyển lên màng lai nhờ liên kết đặc hiệu kháng nguyên- kháng thể. Đâylà phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử và định lượng protein trong các mẫu khác nhau. Sau khi chạy
điện di, protein trong gel được chuyển lên màng lai, ngâm màng lai với kháng thể đặc hiệu có mang enzyme hoặc được đánh dấu phóng xạ. Phức hợp kháng nguyên-kháng thểđược hình thành tại vị trí protein mục tiêu và được phát hiện bằng cơ chất tạo màu hoặc áp phim X quang.
Các bước được tiến hành trong phương pháp Western Blotting:
Điện di mẫu protein trên gel SDS-PAGE
Ngâm gel, màng nitrocellulose và giấy thấm trong dung dịch chuyển màng (Mục 2.1.7) trong 15 phút.
Chuyển protein qua màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng semi dry với
cường độ dòng điện 1mA/cm2 trong 2 giờ.
Ngâm màng trong TBS/T (Mục 2.1.7) 5% sữa gầy hoặc 5% BSA trong 2 giờ
trên máy lắc ngang ở nhiệt độ phòng.
Rửa màng 3 lần bằng TBS/T, 5 phút/lần trên máy lắc.
Ủ màng lai với kháng thểsơ cấp đặc hiệu cho protein mục tiêu trong TBS/T với tỷ lệ pha loãng thích hợp (Bảng 2.2) trong 2 giờ trên máy lắc ở nhiệt độ phòng.
Trong trường hợp Western Blotting phát hiện bio-mIL33 hay msIL-33R:Fc hIgG1 thì kháng thể sơ cấp được thay thế bằng streptavidin-HRP hay anti-Fc hIgG1-HRP.
Rửa màng lai 3 lần bằng TBS/T, 10 phút/lần trên máy lắc.
36