người HEK293
Sau khi được tạo dòng thành công, plasmid pmsIL33R-Fc mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biến nạp vào tế bào HEK293 bằng phương pháp PEI như
mô tảởMục 2.2.5. Tếbào HEK293 mang plasmid được nuôi cấy ởđiều kiện 37oC, 10% CO2 trong 72 giờ. Trong thời gian nuôi cấy, tế bào HEK293 biểu hiện và tiết protein msIL-33R:Fc hIgG1 ra ngoài môi trường do plasmid pmsIL33R-Fc được thiết kế biểu hiện tín hiệu tiết hCD33 ởđầu N của protein mục tiêu.
Dịch nuôi cấy tế bào được cô đặc bằng cách lọc qua cột lọc amicon kích
thước 50KDa. Dịch nuôi cấy tế bào sau cô đặc được xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford (Mục 2.2.7). Protein msIL-33R:Fc hIgG1 cũng được thu nhận từ dịch nuôi cấy tế bào bằng phương pháp kết tủa miễn dịch
thông qua tương tác giữa vùng Fc hIgG1 và protein A trên hạt protein A-sepharose (Mục 2.2.8). Bên cạnh đó, mẫu đối chứng âm là dịch nuôi cấy tế bào HEK293
được chuyển vector rỗng (không mang đoạn gen mã hóa cho protein tái tổ hợp) cũng được thu nhận, cô đặc và thực hiện kết tủa miễn dịch với protein A- sepharose. Các mẫu protein thí nghiệm và đối chứng âm nêu trên được phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và nhuộm coomassie blue. Kết quả được trình bày ở Hình 3.3A cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt trong thành phần protein của mẫu dịch nuôi cấy tế bào HEK293 biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1 và mẫu dịch nuôi tếbào đối chứng (Sup). Như vậy, với 100µg protein tổng số, phân tích SDS-PAGE không cho thấy được sự có mặt của protein tái tổ hợp msIL- 33R:Fc hIgG1 trong dịch nuôi cấy tế bào HEK293. Tuy nhiên, ở mẫu tinh sạch sơ
bộ bằng kết tủa miễn dịch với protein A-sepharose (IP: immunoprecipitation), thành phần protein của mẫu thí nghiệm và đối chứng có sự khác biệt. Ở mẫu IP dịch nuôi cấy tế bào mang vector rỗng, kết quả điện di cho 2 băng protein kích
thước khoảng >25KDa và >55KDa. Với mẫu IP dịch nuôi cấy tế bào mang plasmid pmsIL33R-Fc, ngoài 2 băng protein nêu trên kết quả điện di cho thấy
43
100KDa này có thể là protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 do HEK293 tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường. Kết quả này cũng cho thấy quá trình IP với protein A-
sepharose đã thu nhận được protein mục tiêu và loại bỏđược phần lớn các protein có mặt trong môi trường nuôi cấy tế bào - chủ yếu là từ huyết thanh FCS - ra khỏi mẫu protein sau tinh sạch sơ bộ.
Do băng protein nhìn thấy ở mẫu IP có kích thước 100KDa lớn hơn so với
kích thước lý thuyết của msIL-33R:Fc hIgG1 là 65KDa, khảo sát SDS-
PAGE/Western Blot được thực hiện với kháng thểđặc hiệu cho vùng Fc hIgG1 để
khẳng định đây chính là protein mục tiêu. Giống như dựđoán, kết quả trình bày ở
Hình 3.3B cho phép khẳng định băngprotein kích thước ~100KDa là msIL-33R:Fc hIgG1. Kết quả tương tự cũng được thấy khi làm Western Blot các mẫu IP với kháng thể đặc hiệu cho IL-33R chuột (kết quả không trình bày trong luận văn).
Không có tín hiệu nào được nhìn thấy ở mẫu đối chứng tế bào mang vector rỗng (EV) khi nhuộm màng với kháng thể kháng Fc hIgG1và kháng IL-33R. Như vậy, 2
băng protein kích thước >55KDa và >25KDa có trong mẫu IP dịch thí nghiệm và dịch đối chứng không liên quan đến protein tái tổ hợp mục tiêu mà là những protein có sẵn trong môi trường nuôi cấy tế bào và được tủa với protein A-sepharose. Dựa
vào kích thước của chúng và khả năng tương tác với protein A có thể dự đoán 2 băng protein này là chuỗi nặng (~50KDa) và chuỗi nhẹ (~25KDa) của kháng thể có trong huyết thanh bào thai bò vốn là một thành phần thiết yếu trong môi trường nuôi cấy tế bào HEK293.
Như vậy, protein tái tổ hợp thụ thể IL-33 dạng tự do của chuột gắn với vùng Fc IgG1 của người (msIL-33R:Fc hIgG1) đã được biểu hiện và thu nhận thành công từ hệ thống tếbào người HEK293.
44
Hình 3.3.Biểu hiện và tinh sạch sơ bộ protein msIL-33R:Fc hIgG1 từ hệ thống tếbào người HEK293
Tếbào HEK293 được biến nạp bởi plasmid pmsIL33R-Fc mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1 hoặc vector rỗng (EV: empty vector). Sau 72 giờ, 10ml dịch nuôi cấy tếbào được thu nhận và cô đặc bằng lọc amicon kích thước lỗ 50KDa (Sup), hoặc được ủ trực tiếp với 20µl hạt protein A-sepharose (IP) để thu nhận protein đích msIL33R:Fc hIgG1. 100µg protein tổng số của dịch nuôi cấy tếbào cô đặc (Sup) và 20µl hạt protein A-sepharose sau IP được xử lý trong laemmli buffer và phân tích bằng SDS-PAGE và Western Blot. (A) Các mẫu protein được phân tích bằng SDS-PAGE và nhuộm coomassie blue cho thấy băng protein msIL33R:Fc hIgG1 (mũi tên đen) và chuỗi nặng - chuỗi nhẹ của kháng thể bò (mũi tên xám). (B) Protein msIL33R:Fc hIgG1 trong mẫu IP được phát hiện bằng Western Blot với kháng thể đặc hiệu vùng Fc hIgG1. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với kết quảtương tự.