Nguyên lý của phương pháp ELISA là dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể. Kháng nguyên được xác định dựa vào sự tạo màu của cơ chất
dưới tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể. ELISA có độ nhạy cao nhờ
hoạt tính khuếch đại của enzyme.
Quy trình thực hiện theo hướng dẫn sử dụng bộ kit ELISA mIL-2 của BD biosciences:
Phủđĩa ELISA bằng 100µl kháng thể sơ cấp (capture antibody) đã được pha loãng trong đệm phủ giếng với tỷ lệ 1:500, ủđĩa ở 4oC, qua đêm.
Rửa giếng 3 lần bằng 300 µl dung dịch rửa giếng (Mục 2.1.8) cho mỗi giếng trong mỗi lần rửa, loại bỏ dung dịch rửa giếng.
Cho 200 µl/giếng dung dịch khóa giếng (Mục 2.1.8), ủở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Rửa đĩa như trên.
Chuẩn bị đường chuẩn mIL-2: đường chuẩn được pha loãng bậc 2 trong dung dịch khóa giếng với dãy nồng độ
Cho vào mỗi giếng 100µl mẫu mIL-2 chuẩn ở các nồng độ 200; 100; 50; 25; 12.5; 6.3; 3.1 pg/ml, mẫu dịch nuôi cấy tế bào thử nghiệm (pha loãng 10 lần trong dung dịch khóa giếng) và đối chứng âm. Ủđĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
Rửa đĩa 5 lần bằng 300 µl dung dịch rửa giếng / giếng/ một lần rửa., Loại bỏ hết dung dịch rửa giếng.
Cho 100 µl kháng thể thứ cấp (độ pha loãng 1:500 trong dung dịch khóa giếng ) và streptavidin-HRP (độ pha loãng 1:500 trong dung dịch khóa giếng) vào mỗi giếng, ủ nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Rửa đĩa 7 lần như trên và loại bỏ hết dung dịch rửa giếng.
Thêm 100 µl dung dịch cơ chất ELISA (Mục 2.1.8) vào mỗi giếng, ủđĩa
trong tối, ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút.
Thêm 50 µl dung dịch H2SO4 1M vào mỗi giếng để dừng phản ứng
39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN