bào ở dạng dimer
Trong nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp thì việc biểu hiện protein có hoạt tính sinh học và ổn định về mặt cấu trúc được xem là yếu tố quan trọng nhất. Kháng thể có tính ổn định cao khi tồn tại ở dạng dimer đã được chứng minh qua một số nghiên cứu, như Goto và Hamaguchi đã khảo sát trên vùng CL IgG của
người vào năm 1979 [20] hay Thies và cs đã khảo sát trên vùng CH3 IgG của chuột vào năm 2002 [75]. Đã có một số thụ thể tự do ở dạng phân tử lai có mang
vùng Fc hIgG1 được phát triển thành công và được ứng dụng trong trị liệu như
Amevive, Arcalyst… (Mục 1.5). Vùng Fc hIgG1 được gắn vào một protein có hoạt tính sinh học ngoài mục đích thuận tiện trong tinh sạch và thu nhận protein
47
tái tổ hợp thì nó còn có vai trò làm tăng thời gian tồn lưu của protein trong cơ thể và làm tăng ái lực của protein với phân tử đích. Vùng Fc hIgG1 trên 2 phân tử
protein lai sẽ liên kết với nhau thông qua ba cầu nối disulfide được hình thành giữa các gốc cystein (hai cầu nối phía trước vùng CH2 và một cầu nối trong vùng CH3), nhờđó các protein lai này được biểu hiện ở dạng dimer. Do vậy, cấu trúc
dimer là đặc điểm quan trọng mà protein msIL-33R:Fc hIgG1 được tạo ra trong nghiên cứu này cần có được.
Để kiểm tra protein msIL-33R:Fc hIgG1 có được tế bào HEK293 biểu hiện
ở dạng dimer hay không, protein tái tổ hợp được phân tích bằng SDS/PAGE
trong điều kiện không biến tính (sử dụng laemmli buffer không có β- mercaptoethanol) và biến tính (sử dụng laemmli buffer có β-mercaptoethanol). β- mercaptoethanol trong laemmli buffer là nhân tố làm đứt gãy các cầu nối disulfide giữa 2 đơn phân smIL-33R:Fc hIgG1 nên làm biến đổi cấu trúc dimer thành dạng monomer. Do vậy, nếu protein msIL-33R:Fc hIgG1 tồn tại ở dạng dimer thì phân tích SDS-PAGE không biến tính sẽ cho băng protein có kích
thước cao hơn nhiều so với khi phân tích bằng SDS-PAGE biến tính. Kết quả ghi nhận ởHình 3.5, băng protein thấy ở mẫu điện di không biến tính có kích thước lớn hơn hẳn so với băng protein thấy ở mẫu điện di biến tính. Như vậy protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từ tế bào HEK293 tồn tại ở dạng dimer.
48
Hình 3.5. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện ở dạng dimer
20ml dịch nuôi cấy tế bào HEK293 mang plasmid pmsIL33R-Fc được thu nhận và chia làm 2 phần bằng nhau. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 trong mỗi 10ml dịch nổi được thu nhận bằng IP với 20µl protein A-sepharose. Sau khi rửa nhiều lần, các hạt protein A-sepharose được gia nhiệt 95oC - 10 phút trong laemmli buffer không biến tính (không có β-mercaptoethanol: 1) hay biến tính (có β-mercaptoethanol: 2) và được phân tích bằng SDS/PAGE. Kết quả thể hiện ởtrên là đại diện của 3 lần thí nghiệm lặp lại có kết quảtương tự.