IL-33 trưởng thành của chuột đánh dấu biotin được tạo ra bằng cách đồng biểu hiện IL-33 với enzyme BirA trong vi khuẩn E.coli. IL-33 được thiết kế có mang trình tự acid amin GLNDIFEAQKIEWH ở đầu N. Vị trí lysine (K) trong trình tự trên sẽđược gắn nhóm biotin nhờ xúc tác của enzyme BirA.
Cụ thể quá trình biểu hiện IL-33 đánh dấu biotin được thực hiện như sau: Biến nạp plasmid pmIL33-Bio biểu hiện đồng thời protein IL-33 dạng
trưởng thành của chuột và enzyme BirA vào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) khả nạp.
Một khuẩn lạc đơn E.coli BL21(DE3) mọc trên môi trường LB Agar – penicillin (có mang plasmid pmIL33-Bio) được tăng sinh qua đêm trong 5ml môi
trường LB chứa ampicillin với nồng độ 50µg/ml ởđiều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC.
Chuyển 500µl dịch tăng sinh vi khuẩn vào 50ml môi trường LB - ampicillin và nuôi cấy lắc 160 vòng/phút, 37oC, qua đêm.
33
Chuyển toàn bộ 50ml dịch tăng sinh trên vào 1 lít môi trường LB - ampicillin và nuôi cấy lắc 160 vòng/phút ở 30oC trong 30 phút.
Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG với nồng độ 10µM.
Bổ sung 50µl biotin nồng độ 2mM vào dịch nuôi cấy sau mỗi 20 phút trong vòng 4 giờởđiều kiện lắc 160 vòng/phút, 30oC.
Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn với tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC.
Sinh khối tế bào thu nhận ởtrên được rửa 5 lần bằng PBS lạnh, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút, 4oC, loại dịch nổi.
Rửa sinh khối lần cuối bằng buffer ly giải pH 7,9 chứa Tris HCl 50mM và EDTA 1mM, ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC.
Hòa sinh khối tế bào trong 5ml buffer ly giải trên, tiến hành phá vỡ
màng tế bào bằng sóng siêu âm (sonicator) trong thời gian 2 phút 30 giây với hiệu điện thế 30V.
Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu dịch nổi chứa protein tổng số, giữở -80oC.