IL-33 đánh dấu biotin (bio-mIL33) là nguyên liệu cần thiết cho bước thử
nghiệm hoạt tính của protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từ tế bào HEK293 ở trên. Để tổng hợp bio-mIL33, plasmid pmIL33-bio (do GS. Michael Martin – Đại học Giessen – Đức tặng) mã hóa đồng thời cho protein mIL-33 dạng trưởng thành (mature IL-33) và enzyme biotin ligase BirA được biến nạp vào dòng E. coli
BL21(DE3). Dòng E.coli BL21(DE3) mang plasmid được chọn lọc và tăng sinh trên môi trường LB có ampicillin và cảm ứng biểu hiện protein mIL-33 và BirA bằng IPTG có bổ sung biotin vào môi trường. Trong tế bào E.coli enzyme BirA xúc tác quá trình gắn biotin vào vị trí amino acid lysine trong 1 trình tựpeptide đặc biệt
1. SDS/PAGE không biến tính
49
được thiết kế ở đầu N của mIL-33 (Mục 2.2.10). Sau thời gian nuôi cấy biểu hiện protein, E.coli được thu nhận bằng ly tâm, rửa bằng PBS lạnh và được ly giải bằng sóng siêu âm trong dung dịch Tris HCl pH 7,9. Nồng độ protein tổng số trong dịch ly giải E.colilà 32mg/ml được xác định bằng phương pháp Bradford. Mẫu protein đối chứng âm cũng được chuẩn bịtương tự từ E. coli BL21(DE3) không mang plasmid pmIL33-bio. Hai mẫu protein này được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS- PAGE với cùng hàm lượng protein là 50µg. Kết quả nhuộm coomassie blue cho thấy mẫu protein biểu hiện bio-mIL33 có băng protein ở vị trí ~25KDa đậm hơn so với băngprotein tương ứng ở mẫu đối chứng âm (Hình 3.6A). Đây có thể là vạch protein bio-mIL33 tái tổ hợp biểu hiện ở E.coli. Để kiểm chứng sự hiện diện của bio-mIL33 trong mẫu dịch ly giải E.coli BL21(DE3) ở trên, thử nghiệm SDS-PAGE /Western Blot sử dụng streptavidin-HRP bắt đặc hiệu với gốc biotin được thực hiện (Mục 2.2.11). Kết quả trình bày ởHình 3.6B cho phép khẳng định protein mIL-33 chuột
đánh dấu biotin đã được biểu hiện thành công trên hệ thống E.coli BL21(DE3). Phân tích kết quả điện di SDS-PAGE ởHình 3.6A bằng phần mềm ImageJ cho thấy bio- mIL33 chiếm khoảng 7% protein tổng số của dịch ly giải tế bào E.coli. Dịch protein bio-mIL33 thô này được sử dụng trong các thí nghiệm về sau.
50
Hình 3.6. Biểu hiện IL33 chuột đánh dấu biotin
E.coli BL21(DE3) được biến nạp plasmid mã hóa đồng thời mIL-33 và BirA được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường LB ampicillin. Các protein được biểu hiện cảm ứng bởi IPTG, đồng thời biotin cũng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Sau 4 giờ cảm ứng biểu hiện, E.coli được thu nhận bằng ly tâm và ly giải bằng sóng siêu âm trong dung dịch đệm Tris HCl pH 7,9. 50µg protein tổng số của dịch ly giải E.coli biểu hiện bio- mIL33 và dịch ly giải E.coli đối chứng được phân tích bằng SDS-PAGE và Western Blotting với Streptavidin-HRP. Mũi tên trên hình chỉ vị trí của băng protein bio-mIL33. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với kết quảnhư nhau.
3.5. Sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện in vitro
Protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 hoạt động theo phương thức cạnh tranh IL-33 với IL-33R trên màng tế bào, hạn chế sự tiếp xúc giữa IL-33 và thụ thể của nó và qua đóngăn cản con đường truyền tín hiệu của IL-33 trong tếbào đích.
Đểđạt được mục đích này, trước hết protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện trên HEK293 phải có khảnăng tương tác với bio-mIL33. Thí nghiệm khảo sát khả năng tương tác với bio-mIL33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trong điều kiện in vitro được thực hiện dựa trên phương pháp đồng kết tủa miễn dịch (co-immunoprecipitation) (Mục 2.2.12). Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được ủ với bio- mIL33 ở tỷ lệ 1 phân tử thụ
A B M Bio-mIL33 Ctrl (-) 35 25 Bio-mIL33 M Bio-mIL33 Ctrl (-) 25 30
51
thể tự do : 10 phân tử bio-mIL33 để tạo điều kiện cho phản ứng tương tác. Sau đó các
mẫu tương tác được tiến hành tủa miễn dịch (IP) sử dụng hạt protein A-sepharose gắn
đặc hiệu với vùng Fc. Rửa hạt sepharose và tiến hành phân tích các protein gắn trên hạt bằng phương pháp SDS-PAGE và Western Blot (WB). Bên cạnh đó, các mẫu đối chứng được thực hiện tương tự với dịch ly giải từE. Coli BL21(DE3) không biểu hiện mIL-33 (Ctrl lysate). Kết quảđược trình bày ởHình 3.7.
Ở mẫu thí nghiệm có mặt msIL-33R:Fc hIgG1 và bio-mIL33 trong cùng một hỗn hợp, phân tích WB anti biotin mẫu protein sau IP Fc IgG1 cho một băng tín hiệu có
kích thước tương ứng với bio-mIL33 (~25KDa). Kết quả này nói lên rằng bio-mIL33
đồng kết tủa miễn dịch với msIL-33R:Fc hIgG1 hay nói cách khác là msIL-33R:Fc hIgG1 tương tác được với bio-mIL33. Ở mẫu đối chứng hỗn hợp msIL-33R:Fc hIgG1 và dịch ly giải E.coli không biểu hiện mIL-33, không thấy tín hiệu protein đồng kết tủa miễn dịch với msIL-33R:Fc hIgG1 chứng tỏbăngprotein kích thước ~25KDa đồng kết tủa ở mẫu thí nghiệm không phải là protein tự nhiên của E.coli mà chính là bio-mIL33. Khả năng bio-mIL33 gắn trực tiếp vào hạt protein A-sepharose cũng được loại trừ vì bio-mIL33 không kết tủa cùng với hạt sepharose khi không có mặt msIL-33R:Fc hIgG1 trong hỗn hợp. Tóm lại, tất cả cho thấy protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1
52
Hình 3.7. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từHEK293 tương tác với bio-mIL33 ởđiều kiện in vitro
10µg protein msIL-33R:Fc hIgG1 tinh sạch sơ bộđược cho tiếp xúc với lượng dịch
ly giải vi khuẩn tương ứng với 30µg bio-mIL33 hay dịch ly giải E.coli đối chứng trong đệm PBS 2% BSA ở 4oC trong 4 giờ với sự có mặt của protein A-sepharose. Tương tự, mẫu đối chứng chỉ có bio-mIL33 thô và protein A-sepharose cũng được thực hiện. Sau thời gian ủ, hạt protein A-sepharose được thu nhận bằng ly tâm và rửa kỹđể loại bỏ các protein gắn không đặc hiệu khỏi hạt sepharose (IP: anti Fc IgG). Các protein đồng kết tủa với protein A-sepharose được phân tích bằng SDS-PAGE và Western Blot với streptavidin- HRP (WB: anti biotin) và kháng thể kháng Fc hIgG1 (WB: anti Fc IgG). Ngoài ra, các mẫu hỗn hợp thí nghiệm trên trước khi IP với protein A-sepharose (Input) cũng được phân tích SDS-PAGE/Westen Blot với streptavidin-HRP. Kết quả trình bày ởtrên là đại điện của 3 lần thí nghiệm lặp lại với kết quảtương tự.
3.6. Sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33
Protein msIL-33R:Fc hIgG1 hoạt động theo phương thức cạnh tranh với thụ
thể của IL-33 (IL-33R) hiện diện trên bề mặt tế bào, từ đó hạn chế sự hình thành phức hợp giữa IL-33 và IL-33R và ngăn cản con đường truyền tín hiệu trong tế bào
đích. Kết quả thí nghiệm trình bày ở Mục 3.5 đã chứng minh protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện trên HEK293 có khảnăng tương tác với bio-mIL33. Để làm rõ hơn
53
được thiết kếđể chứng minh khả năng của protein này trong việc ngăn cản IL-33
tương tác với IL-33R biểu hiện trên bề mặt tế bào.
Nguyên tắc của thí nghiệm này là dựa trên kỹ thuật đồng kết tủa miễn dịch để so sánh lượng bio-mIL33 gắn được lên IL-33R có nguồn gốc từ màng tế bào khi không có mặt hoặc có mặt msIL-33R:Fc hIgG1 với lượng tăng dần. Nếu msIL- 33R:Fc hIgG1 có khảnăng ngăn cản bio-mIL33 tương tác với thụ thể trên màng của nó thì khi msIL-33R:Fc hIgG1 hiện diện càng nhiều trong dung dịch, lượng bio-
mIL33 tương tác với IL-33R sẽ càng ít. Một cách ngắn gọn, FLAG-IL33Rα (IL-33R mang epitope FLAG ởđầu N) trong dịch ly giải tế bào HEK293 biểu hiện nhân tạo thụ thể này trên màng tế bào được hấp thụđặc hiệu lên hạt anti-FLAG. Sau đó, hạt mang FLAG-IL33Rα được cho tiếp xúc với bio-mIL33 khi không có hoặc có msIL- 33R:Fc hIgG1 với nồng độtăng dần (tỷ lệ phân tử msIL-33R:Fc hIgG1 và bio-mIL33
là 1:1 và 1:10). Lượng bio-mIL33 bị bắt giữ bởi FLAG-IL33Rα trên hạt anti-FLAG trong những điều kiện khảo sát khác nhau được phân tích bằng SDS-PAGE/Western Blot với streptavidin-HRP. Kết quả thí nghiệm được trình bày ởHình 3.8.
Đầu tiên, khảnăng bio-mIL33 đồng kết tủa miễn dịch do gắn không đặc hiệu trực tiếp lên hạt anti-FLAG hay do quá trình rửa hạt không sạch được loại trừ, vì kết quả
SDS-PAGE/ Western Blot không cho thấy tín hiệu bio-mIL33 trong mẫu IP khi chỉ có mặt bio-mIL33 với hạt anti-FLAG (đã được ủ với dịch phân giải tế bào không biểu hiện FLAG-IL33Rα). Giống như mong đợi, bio-mIL33 trong dung dịch bị bắt lấy bởi FLAG-IL33Rα trên hạt anti-FLAG trong cả 3 trường hợp thí nghiệm. Đáng lưu ý là
lượng bio-mIL33 tương tác với FLAG-IL33Rα giảm xuống rõ rệt khi trong hỗn hợp có mặt của protein msIL-33R:Fc hIgG1 so với khi không có mặt protein này. Hơn nữa,
lượng bio-mIL33 tương tác với FLAG-IL33Rα tỉ lệ nghịch với lượng msIL-33R:Fc
hIgG1 được cho vào hỗn hợp. Như vậy, protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từ tế bào HEK293 có khảnăng cạnh tranh mIL-33 với IL-33R biểu hiện trên bề
mặt tế bào trong thử nghiệm in vitro. Phân tích SDS-PAGE/ Western Blot các mẫu hỗn hợp bio-mIL33/ msIL-33R:Fc hIgG1 trước khi ủ với hạt anti-FLAG (Input) cho thấy sự hiện diện của các protein trong mẫu phù hợp với thiết kế thí nghiệm.
54
Hình 3.8. msIL33R:Fc hIgG1cạnh tranh với FLAG-IL33R biểu hiện trên bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33
3,6x106 tế bào HEK293 được nuôi cấy trong đĩa 100mm và được chuyển plasmid mã hóa thụ thể IL-33 (FLAG-IL33Rα) hoặc vector rỗng. 24 giờ sau, 1ml dung dịch li giải tế bào được cho vào mỗi đĩa tếbào (đã loại bỏmôi trường) và ủở 4oC trong 1 giờđểthu được dịch ly giải tế bào HEK293. FLAG-IL33Rα trong dịch ly giải tếbào được thu nhận bằng cách ủ dịch ly giải từ1 đĩa tế bào với 10µl hạt anti-FLAG ở 4oC qua đêm (IP: anti FLAG). Quá trình IP cũng được thực hiện tương tự với mẫu dịch ly giải tếbào đối chứng không biểu hiện FLAG- IL33Rα. Mỗi mẫu hạt anti-FLAG có mang protein FLAG-IL33Rα trên bề mặt được cho vào 1ml dung dịch PBS 2% BSA có chứa lượng dịch ly giải vi khuẩn tương ứng với 2µg bio- mIL33 và không có hoặc có msIL-33R:Fc hIgG1 với nồng độtăng dần 6,6µg và 66µg (tương ứng với tỷ lệ phân tử msIL-33R:Fc hIgG1 và bio-mIL33 là 1:1 và 1:10). Mẫu anti-FLAG IP với dịch ly giải tế bào không biểu hiện FLAG-IL33Rα cũng được ủ với dung dịch PBS 2% BSA có chứa 2µg bio-mIL33 theo cách thức như trên. Sau 4 giờủở 4oC, hạt anti-FLAG được thu nhận bằng ly tâm và rửa kỹđể loại bỏ các protein gắn không đặc hiệu. Các protein gắn trên hạt được phân tích bằng SDS-PAGE/Western Blot với streptavidin-HRP (WB: anti biotin) để phát hiện bio-mIL33 và kháng thểđặc hiệu với IL-33Rα (WB: anti IL-33Rα) để phát hiện thụ thể IL-33 biểu hiện trên màng tế bào. Mẫu hỗn hợp bio-mIL33/ msIL-33R:Fc hIgG1 trước khi ủ với anti-FLAG bead (Input) cũng được phân tích SDS-PAGE/Western Blot với kháng thể kháng Fc hIgG1 và streptavidin-HRP. Kết quả trình bày trên đây là đại diện của 3 lần lặp lại thí nghiệm với kết quảtương tự. mIL-33 mIL-33Rα Unspecific band msIL-33R:Fc hIgG1 mIL-33
55
3.7. Khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro bào EL-4 nuôi cấy in vitro
Các kết quả thử nghiệm về tương tác protein – protein in vitro giữa msIL- 33R:Fc hIgG1 và bio-mIL33 được trình bày ở Mục 3.5 và Mục 3.6 phần nào cho thấy msIL-33R:Fc hIgG1 được tạo ra trong đề tài có hoạt tính ức chế IL-33. Tuy nhiên, cần phải có một bằng chứng trực tiếp chứng minh hoạt tính sinh học ức chế
IL-33 của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào sống. Trong thí nghiệm này, tế bào lymphoma chuột EL-4 (được cung cấp bởi ATCC – Mỹ) đã
được sử dụng làm mô hình thử nghiệm. Tế bào EL-4 có thể đáp ứng tự nhiên với các cytokine họ IL-1 như IL-1β, IL-18 và IL-33 [2]. Dưới sự kích thích của IL-33, tế bào EL-4 sẽ biểu hiện và giải phóng mIL-2 ra ngoài môi trường nuôi cấy. Khi msIL-33R:Fc hIgG1 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào EL-4, nó sẽ bắt giữ IL-33 tựdo, qua đó sẽ hạn chế sự tiếp xúc của IL-33 với IL-33R trên bề mặt tế
bào, làm tế bào ít bị kích thích hơn nên lượng mIL-2 được tiết ra sẽ giảm xuống. Bằng việc định lượng mIL-2 tạo ra bởi EL-4 dưới tác động của mIL-33 khi không có hoặc có msIL-33R:Fc hIgG1 với nồng độ tăng dần có thể đánh giá được khả năng ức chế hoạt động IL-33 trên mô hình tế bào in vitro của protein msIL-33R:Fc hIgG1 được tạo ra trong đề tài.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách kích thích tế bào EL-4 với IL-33 chuột thương mại (Invitrogen) ở nồng độ 10ng/ml có mặt đồng thời 0,5µM Ca
ionophore A23187. Trước đó, protein msIL-33R:Fc hIgG1 đã được bổ sung vào
môi trường nuôi tế bào EL-4 với nồng độ tăng dần sao cho tỉ lệ số lượng phân tử
giữa msIL-33R:Fc hIgG1 (65KDa) và mIL-33 (18KDa) là 0, 1, 10, 100, 500, 1000 lần (tương ứng với 0, 0.036, 0.36, 3.6, 18 và 36µg/ml msIL-33R:Fc tinh sạch : 10ng/ml mIL-33 thương mại). Đồng thời lô tế bào EL-4 được xử lý với msIL- 33R:Fc hIgG1 như trên nhưng không bị kích thích bằng mIL-33 cũng được chuẩn bị. 8 giờ sau khi kích thích, dịch nuôi cấy tế bào EL-4 được thu nhận và mIL-2 có
56
Kết quả được ghi nhận ở Bảng 3.1 và Hình 3.9 cho thấy lượng mIL-2 được tiết ra từ tế bào EL-4 trong cả 5 nghiệm thức có mặt msIL-33R:Fc hIgG1 đều ít hơn
so với nghiệm thức không có mặt protein này. Hơn nữa, khi tăng nồng độ msIL- 33R:Fc hIgG1 thì lượng mIL-2 được tiết ra từ tế bào EL-4 giảm dần. Hoạt động kích thích tế bào EL-4 của mIL-33 giảm 53,82% khi lượng msIL-33R:Fc hIgG1 sử
dụng cao gấp 10 lần lượng mIL-33 kích thích. Khi tăng lượng msIL-33R:Fc hIgG1 cao gấp 1000 lần lượng mIL-33 kích thích, msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế hoàn toàn
tác động của mIL-33. Tín hiệu nền mIL-2 của các mẫu tế bào EL-4 không bị kích thích bằng mIL-33 khá thấp và đồng nhất cho thấy bản thân msIL-33R:Fc hIgG1 và Ca ionophore ở các nồng độ thí nghiệm không ảnh hưởng gì đến sức sống và sự tiết mIL-2 của tế bào.
Nghiên cứu của Hayakawa và cs năm 2007 cho thấy IL-33R dạng tự do ở liều cao gấp 25 lần lượng IL-33 kích thích đã ức chế được 45% hoạt tính kích thích tế
bào EL-4 (biểu hiện ổn định của IL-33R) trong thử nghiệm luciferase reporter gene assay [22]. Hoạt tính ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 tạo ra trong nghiên cứu
này cao hơn IL-33R dạng tự do được công bố bởi Hayakawa và cs trên cùng mô hình tế bào EL-4 phần nào cho thấy msIL-33R:Fc hIgG1 với cấu trúc dimer có ái lực với IL-33 tốt hơn sIL-33R ở dạng monomer.
Palmer và cs năm 2008 đã nghiên cứu hoạt tính ức chế của sST2-Fc đối với IL-33 trên mô hình tương bào có nguồn gốc từ tủy xương chuột (BMMC) thông qua
định lượng IL-6 do tế bào tiết ra. Công bố này cho thấy hoạt tính kích thích tế bào BMMC của IL-33 bị ức chế 63%, 79% và 100% khi tế bào được xử lý với lượng sST2-Fc cao gấp 138, 1380 và 13800 lần lượng IL-33 kích thích [52]. So với hoạt