Tế bào E. coli có khảnăng hấp thụ DNA ngoại bào ởgiai đoạn pha log. Bề mặt tế bào mang điện tích âm do có sự hiện diện của các phân tử
phospholipids và lipopolysaccharides. Ở điều kiện thường, các phân tử DNA
mang điện tích âm rất khó liên kết với bề mặt tế bào, nhưng khi tếbào được xử lý với Ca2+ thì các phân tử DNA ngoại bào sẽ dễ dàng dính vào bề mặt tế
bào qua trung gian Ca2+. Từ đó, các phân tử DNA có thể được hấp thụ vào trong tế bào chất nhờcơ chế sốc nhiệt hay thực bào.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp:
Cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α vào 5ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy qua
đêm ởđiều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC.
Cấy chuyền 1ml dịch nuôi cấy vào 100ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,3-0,4.
Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50ml lạnh và ủ trong đá 5 – 10 phút.
Các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.
Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 2500 vòng/phút, 7 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
Huyền phù sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ly tâm 2500 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
28
Huyền phù sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Để
trong đá 30 phút. Ly tâm 2500 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
Huyền phù sinh khối trong 2ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Bổ sung 2ml glycerol lạnh 50% và trộn đều.
Chia lượng nhỏ100 μl vào eppendorf 1,5ml và trữở -80oC