bào EL-4 nuôi cấy in vitro
Các kết quả thử nghiệm về tương tác protein – protein in vitro giữa msIL- 33R:Fc hIgG1 và bio-mIL33 được trình bày ở Mục 3.5 và Mục 3.6 phần nào cho thấy msIL-33R:Fc hIgG1 được tạo ra trong đề tài có hoạt tính ức chế IL-33. Tuy nhiên, cần phải có một bằng chứng trực tiếp chứng minh hoạt tính sinh học ức chế
IL-33 của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào sống. Trong thí nghiệm này, tế bào lymphoma chuột EL-4 (được cung cấp bởi ATCC – Mỹ) đã
được sử dụng làm mô hình thử nghiệm. Tế bào EL-4 có thể đáp ứng tự nhiên với các cytokine họ IL-1 như IL-1β, IL-18 và IL-33 [2]. Dưới sự kích thích của IL-33, tế bào EL-4 sẽ biểu hiện và giải phóng mIL-2 ra ngoài môi trường nuôi cấy. Khi msIL-33R:Fc hIgG1 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào EL-4, nó sẽ bắt giữ IL-33 tựdo, qua đó sẽ hạn chế sự tiếp xúc của IL-33 với IL-33R trên bề mặt tế
bào, làm tế bào ít bị kích thích hơn nên lượng mIL-2 được tiết ra sẽ giảm xuống. Bằng việc định lượng mIL-2 tạo ra bởi EL-4 dưới tác động của mIL-33 khi không có hoặc có msIL-33R:Fc hIgG1 với nồng độ tăng dần có thể đánh giá được khả năng ức chế hoạt động IL-33 trên mô hình tế bào in vitro của protein msIL-33R:Fc hIgG1 được tạo ra trong đề tài.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách kích thích tế bào EL-4 với IL-33 chuột thương mại (Invitrogen) ở nồng độ 10ng/ml có mặt đồng thời 0,5µM Ca
ionophore A23187. Trước đó, protein msIL-33R:Fc hIgG1 đã được bổ sung vào
môi trường nuôi tế bào EL-4 với nồng độ tăng dần sao cho tỉ lệ số lượng phân tử
giữa msIL-33R:Fc hIgG1 (65KDa) và mIL-33 (18KDa) là 0, 1, 10, 100, 500, 1000 lần (tương ứng với 0, 0.036, 0.36, 3.6, 18 và 36µg/ml msIL-33R:Fc tinh sạch : 10ng/ml mIL-33 thương mại). Đồng thời lô tế bào EL-4 được xử lý với msIL- 33R:Fc hIgG1 như trên nhưng không bị kích thích bằng mIL-33 cũng được chuẩn bị. 8 giờ sau khi kích thích, dịch nuôi cấy tế bào EL-4 được thu nhận và mIL-2 có
56
Kết quả được ghi nhận ở Bảng 3.1 và Hình 3.9 cho thấy lượng mIL-2 được tiết ra từ tế bào EL-4 trong cả 5 nghiệm thức có mặt msIL-33R:Fc hIgG1 đều ít hơn
so với nghiệm thức không có mặt protein này. Hơn nữa, khi tăng nồng độ msIL- 33R:Fc hIgG1 thì lượng mIL-2 được tiết ra từ tế bào EL-4 giảm dần. Hoạt động kích thích tế bào EL-4 của mIL-33 giảm 53,82% khi lượng msIL-33R:Fc hIgG1 sử
dụng cao gấp 10 lần lượng mIL-33 kích thích. Khi tăng lượng msIL-33R:Fc hIgG1 cao gấp 1000 lần lượng mIL-33 kích thích, msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế hoàn toàn
tác động của mIL-33. Tín hiệu nền mIL-2 của các mẫu tế bào EL-4 không bị kích thích bằng mIL-33 khá thấp và đồng nhất cho thấy bản thân msIL-33R:Fc hIgG1 và Ca ionophore ở các nồng độ thí nghiệm không ảnh hưởng gì đến sức sống và sự tiết mIL-2 của tế bào.
Nghiên cứu của Hayakawa và cs năm 2007 cho thấy IL-33R dạng tự do ở liều cao gấp 25 lần lượng IL-33 kích thích đã ức chế được 45% hoạt tính kích thích tế
bào EL-4 (biểu hiện ổn định của IL-33R) trong thử nghiệm luciferase reporter gene assay [22]. Hoạt tính ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 tạo ra trong nghiên cứu
này cao hơn IL-33R dạng tự do được công bố bởi Hayakawa và cs trên cùng mô hình tế bào EL-4 phần nào cho thấy msIL-33R:Fc hIgG1 với cấu trúc dimer có ái lực với IL-33 tốt hơn sIL-33R ở dạng monomer.
Palmer và cs năm 2008 đã nghiên cứu hoạt tính ức chế của sST2-Fc đối với IL-33 trên mô hình tương bào có nguồn gốc từ tủy xương chuột (BMMC) thông qua
định lượng IL-6 do tế bào tiết ra. Công bố này cho thấy hoạt tính kích thích tế bào BMMC của IL-33 bị ức chế 63%, 79% và 100% khi tế bào được xử lý với lượng sST2-Fc cao gấp 138, 1380 và 13800 lần lượng IL-33 kích thích [52]. So với hoạt tính sST2-Fc được công bố bởi Palmer và cs, hoạt tính của msIL-33R:Fc hIgG1 trong nghiên cứu này cũng cao hơn có thể là do các mô hình tế bào khác nhau đã
được sử dụng trong 2 nghiên cứu (EL-4 và BMMC).
Kết quả thí nghiệm này cho thấy rõ rằng protein msIL-33R:Fc hIgG1 được tạo
ra trong đề tài có hoạt tính sinh học ức chế mạnh hoạt động kích thích tế bào đích
57
Bảng 3.1. Đáp ứng tiết mIL-2 do tác động của mIL-33 từ tế bào EL-4 khi được xử
lý với msIL-33R:Fc hIgG1 ở nhiều nồng độ khác nhau
Tỷ lệ
msIL33R-Fc : mIL-33 (lần)
Lượng mIL-2 do EL-4 tiết ra (pg/ml) Mức độức chế IL- 33 của msIL33R:Fc hIgG1 (%) mIL-33 + Ca ionophore Ca ionophore 0 94.49 ± 8.10 15.55 ± 2.20 0 1 88.81 ± 4.99 16.65 ± 1.45 8.59 10 55.11 ± 4.50 18.66 ± 3.90 53.82 100 31.85 ± 1.38 14.08 ± 4.12 77.49 500 20.68 ± 4.74 16.47 ± 5.50 94.67 1000 14.82 ± 1.14 14.45 ± 5.24 99.53
Hình 3.9. msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế hoạt động của IL-33 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy
1x105 tế bào EL-4 được cấy vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng trong 100µl môi trường RPMI1640 5% FCS và ủ ở 37oC – 5% CO2. 50µl môi trường RPMI1640 5% FCS chứa 2µM Ca ionophore A23187 đựợc bổ sung vào mỗi giếng đểđạt nồng độ Ca ionophore cuối cùng là 0,5µM. Các hỗn hợp gồm msIL-33R:Fc hIgG1 ở các nồng độ khác nhau như 0, 0.144, 1.44, 14.4, 72 và 144µg/ml và mIL-33 nồng độ 40ng/ml được chuẩn bị trong môi trường nuôi tế bào và được ủ ở 37oC trong 15 phút. Tương tự, một loạt dung dịch msIL- 33R:Fc hIgG1 có nồng độnhư trên nhưng không bổ sung mIL-33 cũng được chuẩn bị. Sau đó, 50µl hỗn hợp mIL-33 và msIL-33R:Fc hIgG1 này được bổ sung vào mỗi giếng tế bào ở trên. Như vậy, tổng thể tích của mỗi giếng thử nghiệm là 200µl chứa 1x105 tế bào EL-4, 0,5µM Ca ionophore A23187, 10ng/ml mIL-33 và msIL-33R:Fc hIgG1 ở các nồng độ 0, 0.036, 0.36, 3.6, 18 và 36µg/ml (tương đương 0, 1, 10, 100, 500, 1000 lần số phân tử mIL- 33 kích thích). Tế bào được ủở 37oC – 5% CO2 trong 8 giờ và dịch nuôi cấy tế bào trong mỗi giếng được thu nhận. Nồng độ mIL-2 trong các mẫu dịch nuôi cấy tếbào này được xác định bằng phương pháp ELISA. (A) Lượng mIL-2 do tế bào EL-4 tiết ra trong các nghiệm thức; (B) Mức độức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 ở các nồng độ khác nhau. Kết quả trình bày ởBảng 3.1 và Hình 3.9 là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.
58 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tóm lại, các kết quả nghiên cứu của luận văn cho thấy rằng protein lai IL-33R chuột dạng tựdo có mang vùng Fc hIgG1 đã được biểu hiện từ tế bào HEK293 và tinh sạch sơ bộ thành công. Protein tái tổ hợp này là một glycoprotein được biểu hiện và tiết ra môi trường nuôi cấy tế bào ở dạng dimer. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 có thể tương tác với IL-33 và ngăn không cho cytokine này gắn lên IL-33R
được thu nhận từ màng tế bào trong điều kiện thử nghiệm in vitro. Đáng lưu ý là msIL-33R:Fc hIgG1 tái tổ hợp ức chế mạnh hoạt tính kích thích tế bào EL-4 của IL- 33. Ở liều sử dụng cao gấp 1000 lần liều kích thích IL-33, msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế hoàn toàn sựtác động của IL-33 lên tế bào EL-4.
Đề tài nghiên cứu này là công trình đầu tiên được thực hiện tại Việt Nam nhằm hướng đến việc tạo ra một protein tái tổ hợp có hoạt tính ức chế hoạt động của IL-33. Như đã trình bày, IL-33 là một cytokine tiền viêm mới được phát hiện vào
năm 2005 và có rất nhiều bằng chứng thuyết phục chứng minh vai trò của cytokine này trong việc gây nên các bệnh viêm tự miễn và dị ứng như viêm thấp khớp, viêm ruột kết, hen suyễn, sốc quá mẫn… Do vậy, thành công của đề tài trong việc tạo ra protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 có hoạt tính ức chế IL-33 có ý nghĩa rất quan trọng. Nghiên cứu này mở đường cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá hiệu quả điều trị viêm thấp khớp, hen suyễn…của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình chuột và xa hơn là thử nghiệm lâm sàng.
59
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ