Bradford là phương pháp định lượng protein dựa trên sựthay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm coomassie brilliant blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch có tính acid, khi chưa liên kết với protein thì thuốc nhuộm
có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có
bước sóng hấp thu cực đại là 595 nm. Do đó,độ hấp thụởbước sóng 595 nm có liên hệ trực tiếp tới nồng độ protein.
Phương pháp Bradford được thực hiện trong đĩa 96 giếng với các bước
như sau:
Dựng đường chuẩn với BSA (bovine serum albumin) dãy nồng độ : 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200µg/ml. Tổng thể tích mẫu trong mỗi giếng là 100 µl, lặp lại hai dãy đường chuẩn.
Cho vào mỗi giếng 100 µl các mẫu cần đo nồng độ protein, mỗi mẫu lặp lại hai lần. Có thể pha loãng mẫu bằng nước để nồng độ nằm trong đường chuẩn.
Pha thuốc nhuộm Bradford với tỷ lệ thể tích H2O:Bradford reagent là 3:2
Cho 100 µl thuốc nhuộm trên vào mỗi giếng đã được chuẩn bị mẫu sẵn Kết quảđược đọc bằng máy Elisa ởbước sóng 595nm.
31
2.2.8.Phương pháp thu nhận msIL-33R:Fc hIgG1 từ dịch nuôi cấy tế bào HEK293
msIL-33R:Fc hIgG1 do tế bào HEK293 biểu hiện và tiết ra môi trường ngoại bào được thu nhận và tinh sạch bằng hạt Protein A-sepharose.
Sepharose là các hạt gel agarose được cấu tạo từ các phân tử
polysaccharide, có khảnăng hình thành liên kết cộng hóa trị với protein A nhờ gốc OH trên phân tửđường. Protein A liên kết đặc hiệu với vùng Fc của IgG1 thông
qua các tương tác kỵ nước và tĩnh điện trên chuỗi nặng. Do đó, khi các hạt sepharose lắng xuống sẽ kéo theo protein mục tiêu và từđó có thể thu nhận protein này dễ dàng.
Quá trình thu nhận msIL-33R:Fc hIgG1 từ dịch nuôi cấy tế bào HEK293
được tiến hành như sau:
Rửa 100 µl hạt Protein A-sepharose 3 lần bằng PBS lạnh, ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút.
Cho toàn bộ hạt Protein A-sepharose vào 50 ml dịch nuôi cấy tế bào HEK293 biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1.
Lắc đảo liên tục hỗn hợp ở 4oC trong 16 - 18 giờ.
Ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi và thu nhận hạt Protein A-sepharose.
Rửa hạt Protein A-sepharose 5 lần bằng PBS lạnh.
Thôi giải msIL-33R:Fc hIgG1 ra khỏi hạt Protein A-sepharose bằng dung dịch glycin 100mM, pH2. Trộn đều 100µl dung dịch thôi giải vào hạt Protein A-sepharose, giữtrên đá trong 15 phút, ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút và thu nhận dịch nổi chứa msIL-33R:Fc hIgG1, thêm 10µl dung dịch Tris base 1,5 M, pH 8,8 để trung hòa dịch protein. Lập lại bước thôi giải với glycin pH2 để thu triệt
32
2.2.9.Phương pháp thủy phân nhóm đường trên glycoprotein msIL-33R:Fc hIgG1 bằng PNGase F