Theo kết quả trình bày ở Mục 3.2, protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện từ HEK293 có kích thước khoảng 100KDa, kích thước này lớn hơn khá nhiều so với kích thước lý thuyết của protein được tính bởi công cụ Compute pI/Mw (www.expasy.org/proteomics) là 65KDa. Sự gia tăng kích thước thực tế của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từ tế bào HEK293 so với kích
thước tính toán có thể là do protein tái tổ hợp đã trải qua quá trình glycosyl hóa.
45
Glycosyl hóa là quá trình biến đổi sau dịch mã cần thiết cho sự gấp cuộn và biểu hiện hoạt tính của các phân tửprotein đặc biệt là các protein thụ thể.
Để làm rõ đặc tính glycosyl hóa của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1,
protein được xử lý loại bỏ các nhóm đường bằng enzyme PNGase F (New England Biolabs) như phương pháp nêu ởMục 2.2.9.Đây là một amidase có hoạt tính cắt đứt liên kết giữa GlcNAc (N-Acetylglucosamine) và amino acid asparagine nên loại được các gốc đường khỏi các phân tử glycoprotein. Mẫu protein msIL-33R:Fc hIgG1 được xử lý và không xử lý với enzyme PNGase F
được phân tích bằng SDS-PAGE/Western Blot với kháng thể đặc hiệu vùng Fc
IgG1 người. Giống như mong đợi, phân tích Western Blot cho thấy mẫu msIL- 33R:Fc hIgG1 được xử lý với PNGase F có trọng lượng thấp hơn mẫu protein không xử lý với enzyme (Hình 3.4). Điều này cho thấy protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện ở tế bào HEK293 đã được glycosyl hóa. Đáng chú ý là mẫu msIL-33R:Fc hIgG1 loại bỏ các gốc đường có kích thước đúng với kích thước tính toán là 65KDa.
Kết quả này hoàn toàn hợp lý vì – như đã biết – msIL-33R là một glycoprotein với 9 vị trí có thể được đường hóa và vùng Fc hIgG1 cũng là một glycoprotein. Hiện tượng thay đổi kích thước do đường hóa cũng đã được thấy trong nghiên cứu của Senn và cs năm 2000 biểu hiện T1-Fccó kích thước97KDa từ tế bào gan chuột [68]. Nhiều nghiên cứu cho thấy vùng ngoại bào msIL-33R từ kích thước 38,5 KDa có thể bị glycosyl hóa tới 65 KDa trong tế bào HEK293 và fibroblast, vùng Fc hIgG1 từ 26 KDa cũng bị glycosyl hóa tới 32-35 KDa trong tế bào HEK293 [45], [22], [85].
46
Hình 3.4.Sự glycosyl hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện từ tế
bào người HEK293
10µg protein msIL-33R:Fc hIgG1 được xử lý loại bỏcác nhóm đường bằng 1000 unit enzyme PNGase F ởđiều kiện 37oC trong 2 giờ. Mẫu đối chứng được xử lý tương tựnhưng PNGase F được thay thế bằng 1 thểtích tương ứng PBS. Các mẫu protein được phân tích SDS-PAGE/Western Blot với kháng thểđặc hiệu vùng Fc hIgG1. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với kết quảtương tự.