Điện di trên gel polyacrylamide với sự có mặt của SDS là kỹ thuật phân tách các phân tử protein đã bị biến tính theo kích thước của chúng. Gel
polyacrylamide được hình thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và sự liên kết chéo của methyleneacrylamide do ammonium persulfate (APS)
dưới sự xúc tác của TEMED. Gel polyacrylamide tạo các lỗ trống cho phép các phân tửprotein điqua, được chọn làm môi trường điện di vì nó có tính trơ
về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng.
SDS là tác nhân chính gây biến tính protein. SDS có điện tích âm rất lớn, có khảnăng bọc xung quanh khung polypeptide làm biến tính các phân tử
protein cấu trúc bậc 2 và bậc 3 (không có cầu nối disulfide). Phức hợp SDS-
34
protein, khi đặt trong điện trường thì protein sẽ chạy từ cực âm sang dương
với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước: protein có kích thước càng nhỏ
thì chạy càng nhanh. Ngoài ra, hỗn hợp điện di được đun nóng đến gần nhiệt
độ sôi với sự có mặt của một số chất khửkhác như 2-mercaptoethanol (BME) hay dithiothreitol (DTT) làm biến tính protein bằng cách khử liên kết disulfide dẫn đến tháo xoắn cấu trúc bậc 3 và làm gãy cấu trúc bậc 4 của protein.
Quy trình điện di SDS-PAGE:
Lắp khuôn tạo gel theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Pha gel acrylamide phân tách ở nồng độ mong muốn theo thành phần nêu ở
mục 2.1.7
Đổ nhanh hỗn hợp trên vào khe hẹp giữa hai miếng kính trên khuôn và phủ
nhanh lên bề mặt gel một lớp mỏng isopropanol.
Chờ khoảng 15-30 phút đểgel đông. Đổ và rửa sạch lớp isopropanol trên.
Pha gel góp theo thành phần nêu ở mục 2.1.7 và đổ nhanh gel góp lên trên
gel phân tách và đặt lược vào gel để tạo giếng.
Khi gel khô thì rút lược ra nhẹ nhàng và lắp khuôn gel vào bộđiện di.
Cho buffer chạy điện di vào bên trong khuôn gel và bồn điện di tới đúng
vạch.
Chuẩn bị mẫu protein biến tính để điện di: trộn 20 µl mẫu protein với 10 µl laemmli buffer 3X (Mục 2.1.7), gia nhiệt 95oC trong 10 phút.
Nạp mẫu protein đã biến tính vào từng giếng trên gel, đậy nắp bồn điện di và chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong khoảng 1-2 giờ.
Sau khi chạy điện di xong, tách gel ra nhẹ nhàng khỏi tấm kính, có thể xem kết quả bằng cách nhuộm coomassie brilliant blue hoặc dùng gel để chuyển màng làm Western Blotting.
Quy trình SDS-PAGE không biến tính (non-reducing SDS-PAGE) được thực hiện như trên nhưng sử dụng laemmli buffer không có β-Mercaptoethanol.
35