Quá trình giải trình tự được tiến hành tuần tự theo 3 bước: thứ nhất thực hiện phản ứng sequencing, tiếp theo là làm sạch sau sequencing và cuối cùng là tiến hành giải trình tự trên máy AB-3130 của hãng AB (Applied Biosystem).
Sản phẩm PCR được làm sạch theo phương pháp 7 được sử dụng là nguyên liệu cho phản ứng sequencing. Phản ứng sequencing được thực hiện theo bộ kít BigDye Terminator V 3.1 Cycle Sequencing của hãng AB. Thành phần và thể tích phản ứng được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Thành phần và thể tích phản ứng giải trinh tự
Thành phần Thể tích
H2O 6,4 µl Bigdye® Terminator V 3.1 Cycle (2,5 X) 8 µl Bigdye Terminator V 1.1, V3.1 Sequencing
Buffer (5X)
4 µl
Primer (3,2pmol/µl) 1 µl
Template (ở mục 2.2.3 (7)) 0,6 µl
Tổng thể tích phản ứng 20 µl
Phản ứng sequencing trên máy PCR – Eppendorf. Chu trình nhiệt chung cho mọi phản ứng sequencing như Protocol - BigDye Terminator V 3.1 (theo khuyến cáo của hãng) :
Chu kì 1: biến tính ở nhiệt độ 960 C trong 1 phút
Chu kì 2: Gồm 3 bước, lặp 25 chu kỳ. Nhiệt độ và thời gian tương ứng cho mỗi bước như sau: 960C trong 10 giây; 500C trong 5 giây; 600C trong 4 phút.
Chu kì 3: hạ nhiệt độ xuống 40 C ở ∞
Phương pháp làm sạch sau phản ứng sequencing
Làm sạch sau phản ứng sequencing được thực hiện theo BigDye® XTerminator™- Purification Kit của hãng AB. Hóa chất và dụng cụ sử dụng gồm:
- SAMTM Solution : lọ 9 ml
- X TerminatorTM Solution : 2 ml
- Đĩa chạy phản ứng 96 giếng tấm cao su đậy, khay cố định đĩa (cung cấp
theo theo máy), tấm phủ nylon.
- Máy lắc đĩa IKA® Vibrax VXR basic và máy li tâm đĩa Hettich Rotanta 460R C5605.
Tiến hành:
- Lấy theo tỉ lệ 90 µl dung dịch SAMTM Solution + 20 µl dung dịch XTerminatorTM Solution cho một mẫu vào ống eppendorf, lắc kĩ.
- Chia 110 µl dung dịch này vào mỗi giếng của đĩa chạy sequencing
- Tra mẫu 20 µl (sau chạy sequencing) vào mỗi giếng
- Phủ đĩa bằng nylon, tiến hành lắc đĩa trên máy lắc 1800 vòng/phút trong 30 phút.
- Ly tâm đĩa ở 1.000g trong 3 phút, nhiệt độ 150C.
- Bỏ nylon phủ, đậy đĩa bằng tấm cao su
- Sau khi làm sạch, có thể cho đĩa lên máy chạy hoặc bảo quản ở 40C.
Giải trình tự trên máy giải trình tự tự động:
Protocol được lập cho giải trình tự tự động theo module BigDye® XTerminator™-sử dụng để làm sạch sau sequencing bằng kít (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Polymer: POP7 và Capillary loại 3130 & 3100 – Avent Capillary Array - 36cm.