Gen CAPN1 được coi là một ứng cử gen liên quan đến độ mềm của thịt. Gen
CAPN1 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể 29 và mã hóa cho enzyme protease
μ-calpain, một loại enzyme làm phân rã protein sợi cơ sau quá trình giết mổ và là một enzyme quan trọng nhất liên quan đến tính mềm của thịt bò (White và cs, 2005). Ở người, gen CAPN1 được xác định có 22 exon với kích thước khoảng 30 kb và gen CAPN1 ở bò có cấu trúc tương tự. Tác giả Page và cộng sự (2002) đã tiến hành giải trình tự toàn bộ 22 exon và 19 trên 21 intron gen CAPN1 ở bò và đã xác định được một số điểm đa hình. Phần lớn các điểm đa hình được tìm thấy ở vùng intron hoặc là các đột biến đồng nghĩa ngoại trừ hai đột biến được phát hiện
tại exon 9 (C/G) và exon 14 (G/A). Đột biến nucleotide trên exon 9 làm thay đổi giữa hai axít amin alanine/glycine và trên exon 14 làm thay đổi giữa hai axít amin isoleucine/valine tại các vị trí tương ứng trên phân tử protein là 316 và 530. Ngoài ra một đột biến khác (C/T) tại vị trí 4751 ở intron 17 gen CAPN1 cũng được xác định liên quan đến tính mềm của thịt bò và chỉ thị này đã được kiểm tra trên các giống bò thuôc bò có u, không có u và bò lai (Page và cs, 2004; Casas và cs, 2005; White và cs, 2005). Gần đây kết quả nghiên cứu của Van Enennaam và công sự (2007) đã khẳng định rằng đột biến tại các vị trí 316 và 4751 gen CAPN1 liên quan đến độ mềm của thịt ở các giống bò khác nhau. Các đột biến này đã trở thành các chỉ thị di truyền được sử dụng hỗ trợ trong quá trình chọn lọc đồng thời là một trong những chỉ thị di truyền mang tính chất thương mại để kiểm tra tính trạng mềm thịt ở các giống bò có ký hiệu “GeneSTAR Tenderness” bao gồm các chỉ thị: CAPN1-316, CAPN1-530 và CAPN1-4741.
5.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên quần thể gồm 7 nhóm bò vàng địa phương: bò vàng Lạng Sơn, bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bò vàng Nghệ An, bò U Rìu, bò vàng Phú Yên, bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu và giống bò ngoại nhập Brahman. Địa điểm và số mẫu của mỗi nhóm được thể hiện ở bảng 5.1.
Bảng5. 1: Địa điểm và số lượng mẫu phân tích ở các nhóm bò
Nhóm bò Địa điểm thu mẫu Số mẫu
Bò vàng Hà Giang Đồng Văn- Hà Giang 66
Bò vàng Lạng Sơn Bình Gia- Lạng Sơn 66
Bò vàng Thanh Hóa Như Xuân- Thanh Hóa 66
Bò vàng Nghệ An Yên Thành- Nghệ An 66
Bò vàng U Rìu Nam Đàn- Nghệ An 66
Bò vàng Phú Yên Sông Hinh- Phú Yên 66
Bò vàng Bà Rịa Châu Đức- Vũng Tàu 66
Bò Brahman Củ Chi- TP HCM 66
Tổng 528
5.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các mẫu mô tai của mỗi cá thể ở các nhóm bò nói trên được thu thập đảm bảo hạn chế về quan hệ huyết thống. Các mẫu này được bảo quản trong dung dịch cồn 98%, sau đó đưa về phòng thí nghiệm và bảo quản tiếp ở -200C trước khi tiến hành tách chiết ADN. Sau đó ADN hệ gen được tách chiết từ các mẫu mô theo quy trình của bộ kít Bioneer (Hàn Quốc).
Phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn gen TG5 được tiến hành với tổng thể tích 25 μl, bao gồm: 50 ng ADN hệ gen; 10pM mồi xuôi và ngược; 0,2mM dNTP; 1,5 mM MgCl2; 1UI Taq polymerase và đệm PCR 10x của hãng Fementas. Hai mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng theo Barendse (1997) có trình tự như sau:
Mồi xuôi: 5’ GGGGATGACTACGAGTATGACTG 3’
Mồi ngược: 5’ GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGTA 3’
Chu trình nhiệt của phản ứng được thực hiện theo các bước: Trước tiên ADN khuôn được biến tính ở 940 C trong 5 phút, tiếp theo đó với 35 chu kỳ lặp lại ở điều kiện: biến tính ở 940 C trong 35 giây, gắn mồi ở 630 C trong 45 giây, tổng hợp chuỗi ADN ở 720 C trong 35 giây, cuối cùng kết thúc phản ứng ở 720 C trong 10 phút.
Để phân tích đa hình gen TG5, sản phẩm PCR được tiến hành cắt bởi enzyme giới hạn BstYI. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện trong thể tích 25 μl, bao gồm: 2,5 μl đệm cắt, 15 μl sản phẩm PCR, 0,2 μl (5U) enzyme cắt và 7,3 μl H2O. Phản ứng được ủ qua đêm ở 370C. Sản phẩm cắt enzyme được kiểm tra trên gel agarosse 2%, nhuộm bằng Ethidium Bromide và phát hiện dưới ánh sáng UV.
Phản ứng PCR nhân đặc hiệu và phân tích đa hình đoạn gen DGAT1
- Chúng tôi sử dụng cặp mồi De và cộng sự (2004) để nhân đoạn gen DGAT1 ở các mẫu bò nghiên cứu. Cặp mồi có trình tự như sau:
Mồi xuôi: 5'-TGGGCTCCGTGCTGGCCCTGATGGTCTA- 3 '
Mồi ngược: 5'-TTGAGCTCGTAGCACAGGGTGGGGGCGA-3 '
Bảng 5.2: Thành phần phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn gen DGAT1
Thành phần phản ứng PCR Thể tích (l)
- Đệm (10X) 1, 5 µl
- MgCl2 (25mM) 0, 9 µl
- dNTP (2mM) 1, 5 µl
- Mồi xuôi (10pmol/µl) 0, 6 µl
- Mồi ngược (10pmol/µl) 0, 6 µl
- Hot start Taq DNA Polymerase (5U/µl) 0, 2 µl
- H2O 8, 7 µl
- ADN 1 µl
Tổng 15 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng được thực hiện theo các bước: Trước tiên ADN khuôn được biến tính ở 940 C trong 5 phút, tiếp theo đó với 35 chu kỳ lặp lại ở điều kiện: biến tính ở 940 C trong 40 giây, gắn mồi ở 630 C trong 45 giây, tổng hợp chuỗi ADN ở 720 C trong 40 giây, cuối cùng kết thúc phản ứng ở 720 C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được tiến hành cắt bởi enzyme giới hạn CfrI. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện trong thể tích 20 μl, bao gồm: 2 μl đệm cắt, 15 μl sản phẩm PCR, 0,5 μl (5U) enzyme cắt và 2,5 μl H2O. Phản ứng được ủ qua đêm ở 370C. Sản phẩm cắt enzyme được kiểm tra trên gel agarosse 2,5%, nhuộm bằng Ethidium Bromide và phát hiện dưới ánh sáng UV
Phản ứng PCR nhân đặc hiệu và phân tích đa hình vùng 316 và 4741 gen CAPN1
Phản ứng PCR nhân đặc hiệu vùng 316 và 4741 gen CAPN1 được tiến hành với tổng thể tích 25 μl, bao gồm: 50 ng ADN hệ gen; 10pM mồi xuôi và ngược; 0,2mM dNTP; 1,5 mM MgCl2; 1UI Taq polymerase và đệm PCR 10x của hãng Fementas. Hai cặp mồi dùng để nhân bản vùng 316 và 4751 gen CAPN1 được sử dụng theo Soria và cs (2010).
Chu trình nhiệt của phản ứng được thực hiện theo các bước: Trước tiên ADN khuôn được biến tính ở 940 C trong 5 phút, tiếp theo đó với 35 chu kỳ lặp lại ở điều kiện: biến tính ở 940 C trong 35 giây, gắn mồi ở 620 C (cho phản ứng nhân vùng 316) và 740C (cho nhân vùng 4751) trong 45 giây, tổng hợp chuỗi ADN ở 720 C trong 35 giây, cuối cùng kết thúc phản ứng ở 720 C trong 10 phút.
Để phân tích đa hình chỉ thị CAPN1-316 và CAPN1- 4751, sản phẩm PCR được tiến hành cắt tương ứng bởi enzyme giới hạn BgtI và BsaJI. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện trong thể tích 25 μl, bao gồm: 2,5 μl đệm cắt, 15 μl sản phẩm PCR, 5UI (0,2 μl) enzyme cắt giới hạn và 7,3 μl H2O. Phản ứng được ủ qua đêm ở 37 0C. Sản phẩm cắt enzyme được kiểm tra trên gel agarosse 2,5%, nhuộm
bằng Ethidium Bromide và quan sát dưới ánh sáng UV.
Phân tích số liệu
Tần số kiểu gen và tần số alen gen TG5, DGAT1 và chỉ thị CAPN1-316 và CAPN1-4751 được tính trực tiếp. Sai khác về tần số kiểu gen và alen giữa các nhóm bò được tính theo phương pháp so sánh khi bình phương (χ2) bằng phần mềm Minitab 14.
5.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
