e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
2.2.2.4 Kết tinh
Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phịng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại đến 6.5 sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đĩ duy trì ở 4oC qua đêm, sau đĩ ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ để thu nhận tinh thể.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 2.2.2.5 Tái kết tinh
Hịa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch cĩ nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hịa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phịng. Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đĩ ly tâm thu tủa. Hoạt độ riêng của enzyme cĩ thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
2.2.2.6 Đơng khơ chân khơng.
Tủa protein thu được đem đơng khơ chân khơng để loại bỏ nước. Protein sau khi đơng khơ chân khơng được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Qui trình thu nhận papain tinh khiết cĩ thể được tĩm tắt lại theo sơ đồ 2.2
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry[1, 4, 12, 36]
Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều cĩ chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng loại với nhau cĩ hàm lượng các acid amin này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất cĩ màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế ta cĩ thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein.
Hĩa chất
Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hịa tan trong NaOH N/10 thành 100ml.
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hịa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành 100ml.
Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1.
Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin pha với nước cất thành 100ml.
Dựng đƣờng chuẩn
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thường là albumin của bị đã đơng khơ. Tiến hành pha albumin cĩ nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới.
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein mg/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Nước cất (ml) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5
Hút 0.4ml dung dịch protein cĩ nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Sau đĩ vẽ đường chuẩn biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml).
Xác định hàm lƣợng protein cĩ trong mẫu:
Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống nghiệm sạch và đã được sấy khơ. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein cĩ trong mẫu nghiên cứu.
2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson[1, 4]
Nguyên tắc
Casein bị phân giải trong mơi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo thành sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hịa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định tyrosin và tryptophan hịa tan bởi thuốc thử Folin.
Dựng đƣờng chuẩn Tyrosin
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 1 2 3 4 5 6 Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch HCl 0.2N (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sĩng 720nm
Ống số 1 là ống thử khơng (TK), các ống cịn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và độ hấp thu quang ở bước sĩng 720nm.
Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD.
Xác định lƣợng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu
Cân chính xác 0.1g mẫu protein hịa tan trong 100ml nước cất, tạo thành dung dịch protein cĩ nồng độ 0.001g/ml.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm
1 2
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35.5o
C Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 4 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lơ, mỗi lơ hai ống để lấy trung bình đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sĩng 660nm hoặc 720nm. Dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin.
2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl[1, 4] 2.2.5.1 Nguyên tắc: 2.2.5.1 Nguyên tắc:
Chất đạm khi đem vơ cơ hĩa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phĩng thích ra amoniac theo phương trình như sau:
(NH4)2SO4 + NaOH ---> 2NH3 + H2O + Na2SO4
Lượng amoniac phĩng thích ra sẽ được hơi nước lơi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác cĩ chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phĩng thích ra, cĩ nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH3 + H2O + H2SO4 ---> (NH4)2SO4 + H2O
2.2.5.2 Cách tính:
N = 1.4*V (mg/ml) Trong đĩ:
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
N: Số gam đạm tổng số cĩ trong 1 lít nguyên liệu lỗng hay 1kg nguyên liệu rắn.
V = V0 – V
V0: thể tích NaOH N/100 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/100 mẫu thử thật.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen)[1, 4] 2.2.6.1 Nguyên tắc 2.2.6.1 Nguyên tắc
Trong phân tử acid amin, peptid, protein cĩ một đầu chức là nhĩm –COOH như là một acid cịn đầu kia là nhĩm –NH2 được xem như là một base, cịn các amin tự do cũng như amoniac khi hịa tan thường ở dưới dạng amonium NH4+ kết hợp với một anion thường là clorur, sulfat, phosphat…
Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol, formol sẽ tác dụng lên nhĩm -NH2 để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc hexamethylen). HOOC C R NH2 H + HCHO HOOC C R N H CH2 + H2O + HCHO R N CH2 + H2O RNH4+Cl- + HCl
Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do (trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc amoniac). Nên ta cĩ thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một cách gián tiếp được lượng –NH2.
Khi hàm lượng đạm formol khơng tăng theo thời gian cĩ nghĩa là phản ứng thủy phân đã kết thúc
2.2.6.2 Tiến hành
Trung hịa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đĩ vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hịa.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài này chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu 10 lần) thêm vào đĩ 10ml dung dịch formol ½ đã trung hịa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hồn tồn, sau đĩ định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng.
Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử khơng (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình.
2.2.6.3 Cách tính
Số gam đạm formol cĩ trong 1 lít nguyên liệu = 1.4*V (g/lít) Trong đĩ:
V = V – V0
V0: thể tích NaOH N/10 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/10 mẫu thử thật.
2.2.7 Xác định đạm amoniac[1, 4] 2.2.7.1 Nguyên tắc
Trong nguyên liệu chứa đạm thường cĩ một loại đạm nằm dưới dạng “vơ cơ” (muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin), vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này khơng cần cho cơ thể, nếu cĩ sự hiện diện của nĩ với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất’.
Những loại đạm này thường cĩ tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lơi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đĩ đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này.
2(NH4)+ + Mg(OH)2 ---> 2NH3 + 2H2O + Mg2+ 2NH3 + H2SO4 ----> (NH4)2SO4
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.7.2 Tiến hành
Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng 20 lần (hoặc cân chính xác một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình cầu 500ml, thêm vào đĩ 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải cĩ màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra, lắc đều, đun sơi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam giác cĩ chứa sẵn 10ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10. Chưng cất trong 15-20 phút kể từ khi dung dịch trong bình cầu sơi. Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp thụ vào dung dịch H2SO4. Lấy bình tam giác ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi lấy ra).
Định phân lượng acid dư bằng NaOH cĩ chuẩn độ là x N/10 từ màu xanh tím sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai. Thực hiện ba lần thử thật và ba lần thử khơng.
2.2.7.3 Cách tính
Số gam đạm NH3 cĩ trong 1 lít nguyên liệu = (1.4*V)/2.5
V = (Vt – V0) là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phĩng thích đã được hấp thụ trong H2SO4.
2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thơ.[15, 27] với xúc tác papain thơ.[15, 27]
2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo:
Sử dụng dung mơi eter dầu hỏa: cho dung mơi vào bánh dầu đậu phộng đã xay nhuyễn với tỷ lệ khối lượng dung mơi trên cơ chất là 3:2. Khuấy đều trong 3 giờ ở 70oC, sau đĩ lọc bỏ dung mơi (tiến hành 3 lần). Sau đĩ cho nước vào với tỷ lệ trên sản phẩm là 2:1, khuấy đều, đem lọc. Thực hiện sự rửa này 7 lần. Sản phẩm thu được đem sấy khơ ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo.
2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng[5, 30, 31, 37]
Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với dung dịch đệm phosphate là 1:10. Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
erlen 100ml, thêm vào 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1M. Bánh dầu đậu phộng được trộn với dung dịch đệm phosphate để đạt được pH mong muốn, hỗn hợp sau đĩ được gia nhiệt và khuấy từ liên tục. Khi phản ứng đạt đến nhiệt độ cần khảo sát, cho enzyme vào với tỉ lệ thích hợp, phản ứng được tiến hành trong 26 giờ. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, lấy 0.1 gam dịch thủy phân từ erlen trên, thêm nước sơi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch, đem lọc. Hút 10ml dịch lọc đem xác định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen, phần dung dịch cịn lại trong bình định mức dùng để xác định lượng protein theo phương pháp Lowry.
2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân[39]
Papain cĩ tính chất của endopeptidase thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng chủ yếu thành peptide theo phản ứng sau:
R1 N C H H R3 C O N H C R4 C H R2 O HOH + N C H H R3 C O R1 OH H2N C R4 CO R2 H +
Ngồi ra, papain cịn cĩ tính chất của exopeptidase thủy phân các peptide thành các acid amin theo phản ứng sau:
H2N C H R2 C O N H C R3 C H R1 O HOH + H2N C H R3 C O OH H2N C R4 CO R1 H +
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%) được tính dựa trên tỉ lệ hàm lượng acid amin hịa tan trong nước của dung dịch sau phản ứng so với hàm lượng protein ban đầu được xác định thơng qua hàm lượng nitơ tổng.
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo cơng thức như sau: 100 * P G H Trong đĩ:
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
G: hàm lượng acid amin tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo phương pháp Lowry.
P: hàm lượng protein ban đầu trong bánh dầu đậu phộng xác định theo phương pháp Kjeldahl.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ
Chúng tơi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già xanh, quả gần chín) ở trên cùng một lồi và cùng một phương pháp làm khơ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau.
Loại quả Khối lượng quả (g)
Khối lượng nhựa lấy (g)
Tỉ lệ nhựa thơ trên quả (%) Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21 Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26 Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18
Nhận xét: lượng papain thơ thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tơi nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thơ là khi quả đu đủ được 50 – 100 ngày tuổi.
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI
Nhựa tươi được làm khơ ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC bằng các phương pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Các phƣơng pháp làm khơ nhựa đu đủ
Phương pháp làm khơ Hình thức cảm quan Phơi nắng 1-2 nắng Vĩn cục,vàng nâu Sấy nĩng, cĩ quạt giĩ 24 giờ Vĩn cục, vàng nhạt
Đơng khơ chân khơng 8 giờ Vẩy mỏng, ĩng ánh và trắng sáng Nhận xét:
Chất lượng papain thơ thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau. Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm chất lượng càng kém.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Tuy cĩ nhiều phương pháp khác nhau để làm khơ nhựa tươi nhưng phương pháp đơng khơ chân khơng là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất lượng nhựa. Do đĩ, tồn bộ nhựa tươi được đơng khơ chân khơng để loại nước và nhựa sau đơng khơ được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tơi tiến hành đơng khơ trong 8 giờ và thu được 5 gam chế phẩm đơng khơ.
3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHƠ
Nhựa tươi sau khi đã đơng khơ chân khơng, chúng tơi tiến hành sơ chế bằng dung mơi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất. Sản phẩm sau quá trình sơ chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein. Kết quả chạy điện di của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a:
Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khơ ở trái non sơ chế bằng dung