e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
2.1. HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Hĩa chất
Thuốc thử Folin – Merck, Đức. Tyrosin – Merck, Đức.
Casein – Merck, Đức. Albumin – Merck, Đức.
Dung dịch Citrat Natri 1%: cân chính xác 1g Citrat Natri pha với nước cất thành 100ml.
Dung dịch Na2HPO4 1/15M: cân chính xác 5.9690g Na2HPO4.12H2O hịa tan trong nước cất và định mức cho đủ 250ml.
Dung dịch KH2PO4 1/15M: cân chính xác 0.9072g KH2PO4 hịa tan trong nước cất và định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M.
Dung dịch casein 1%: đun sơi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hồn tồn rồi định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch TCA 5%: hịa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0.5N: hịa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml. Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch HCl 0.2N vừa đủ 500ml.
Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha lỗng 5ml dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu.
2.1.2. Thiết bị
Máy quang phổ UV Aglient 8453.
Máy đơng khơ chân khơng Christ, Alpha 1- 2 Ldplus
Cùng các thiết bị khác của phịng thí nghiệm : máy ly tâm, máy khuấy từ gia nhiệt...
2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái[3, 8, 11, 16, 10, 20]
Quả: lấy ở những quả đang cịn xanh, vỏ quả mịn, cĩ trọng lượng từ 0.3-1 kg là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa khơng sánh sệt, hoạt tính enzyme khơng cao. Quả cĩ vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho ít nhựa. Để thu enzyme cĩ hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần tuổi.
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn cĩ độ ẩm khơng khí cao). Khi độ ẩm khơng khí thấp, dịng nhựa chảy chậm và đặc rất khĩ thu nhận.
Mùa khơ: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao
Mùa mưa: nhựa nhiều, lỗng, nồng độ protein thấp Tiến hành
Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh cịn ở trên cây
Dùng dao inox cĩ đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (khơng rạch sâu quá 2cm, nếu khơng dịch nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu được).
Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh khơng cho nhựa tiếp xúc lâu với khơng khí và để bảo đảm hoạt tính của papain cĩ trong nhựa.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh khơng cho chất bẩn hoặc cơn trùng lẫn vào.
Khơng nên trộn nhựa khơ với nhựa tươi vì nĩ làm giảm chất lượng nhựa.
Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ
Quả cĩ thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày. Lần đầu tiên cĩ thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa những đường rạch trước đĩ.
Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh khơng cho nhựa tiếp xúc vào da vì dễ gây bỏng. Đồng thời cũng khơng nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng, …để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme. Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằng nhựa hoặc thép khơng rỉ.
Nhựa tươi khơng bền vì thế nên đơng khơ chân khơng ngay sau khi thu nhận, nhựa đơng khơ được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu.
2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết[8, 18, 23, 28, 40, 42, 44]
Trong thành phần của nhựa đu đủ tươi ngồi enzyme papain, chymopapain cịn cĩ một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các tạp chất khác. Để cĩ được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ cĩ hiệu quả thì phải cĩ quy trình hịa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất cặn, nhựa, tạp lớn.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Trộn 180g nhựa đu đủ khơ với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phịng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hịa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới 5.7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine. Sau đĩ rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (cĩ thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khơ được sử dụng và quá trình này cĩ thể rất chậm. Nước lọc cĩ màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước cịn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.[25, 27, 28]
2.2.2.1 Loại bỏ các chất khơng tan ở pH 9.
Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M. Tủa xám tạo thành cĩ thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút. Dịch trích ở giai đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.
2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate
Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hịa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 4000rpm. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc cĩ thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hịa.
2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl
Hịa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để thu tủa, bỏ dịch lỏng.
2.2.2.4 Kết tinh
Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phịng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại đến 6.5 sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đĩ duy trì ở 4oC qua đêm, sau đĩ ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ để thu nhận tinh thể.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 2.2.2.5 Tái kết tinh
Hịa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch cĩ nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hịa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phịng. Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đĩ ly tâm thu tủa. Hoạt độ riêng của enzyme cĩ thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
2.2.2.6 Đơng khơ chân khơng.
Tủa protein thu được đem đơng khơ chân khơng để loại bỏ nước. Protein sau khi đơng khơ chân khơng được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Qui trình thu nhận papain tinh khiết cĩ thể được tĩm tắt lại theo sơ đồ 2.2
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry[1, 4, 12, 36]
Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều cĩ chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng loại với nhau cĩ hàm lượng các acid amin này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất cĩ màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế ta cĩ thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein.
Hĩa chất
Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hịa tan trong NaOH N/10 thành 100ml.
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hịa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành 100ml.
Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1.
Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin pha với nước cất thành 100ml.
Dựng đƣờng chuẩn
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thường là albumin của bị đã đơng khơ. Tiến hành pha albumin cĩ nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới.
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein mg/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Nước cất (ml) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5
Hút 0.4ml dung dịch protein cĩ nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Sau đĩ vẽ đường chuẩn biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml).
Xác định hàm lƣợng protein cĩ trong mẫu:
Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống nghiệm sạch và đã được sấy khơ. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein cĩ trong mẫu nghiên cứu.
2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson[1, 4]
Nguyên tắc
Casein bị phân giải trong mơi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo thành sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hịa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định tyrosin và tryptophan hịa tan bởi thuốc thử Folin.
Dựng đƣờng chuẩn Tyrosin
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 1 2 3 4 5 6 Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch HCl 0.2N (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sĩng 720nm
Ống số 1 là ống thử khơng (TK), các ống cịn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và độ hấp thu quang ở bước sĩng 720nm.
Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD.
Xác định lƣợng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu
Cân chính xác 0.1g mẫu protein hịa tan trong 100ml nước cất, tạo thành dung dịch protein cĩ nồng độ 0.001g/ml.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm
1 2
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35.5o
C Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 4 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lơ, mỗi lơ hai ống để lấy trung bình đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sĩng 660nm hoặc 720nm. Dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin.
2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl[1, 4] 2.2.5.1 Nguyên tắc: 2.2.5.1 Nguyên tắc:
Chất đạm khi đem vơ cơ hĩa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phĩng thích ra amoniac theo phương trình như sau:
(NH4)2SO4 + NaOH ---> 2NH3 + H2O + Na2SO4
Lượng amoniac phĩng thích ra sẽ được hơi nước lơi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác cĩ chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phĩng thích ra, cĩ nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH3 + H2O + H2SO4 ---> (NH4)2SO4 + H2O
2.2.5.2 Cách tính:
N = 1.4*V (mg/ml) Trong đĩ:
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
N: Số gam đạm tổng số cĩ trong 1 lít nguyên liệu lỗng hay 1kg nguyên liệu rắn.
V = V0 – V
V0: thể tích NaOH N/100 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/100 mẫu thử thật.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen)[1, 4] 2.2.6.1 Nguyên tắc 2.2.6.1 Nguyên tắc
Trong phân tử acid amin, peptid, protein cĩ một đầu chức là nhĩm –COOH như là một acid cịn đầu kia là nhĩm –NH2 được xem như là một base, cịn các amin tự do cũng như amoniac khi hịa tan thường ở dưới dạng amonium NH4+ kết hợp với một anion thường là clorur, sulfat, phosphat…
Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol, formol sẽ tác dụng lên nhĩm -NH2 để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc hexamethylen). HOOC C R NH2 H + HCHO HOOC C R N H CH2 + H2O + HCHO R N CH2 + H2O RNH4+Cl- + HCl
Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do (trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc amoniac). Nên ta cĩ thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một cách gián tiếp được lượng –NH2.
Khi hàm lượng đạm formol khơng tăng theo thời gian cĩ nghĩa là phản ứng thủy phân đã kết thúc
2.2.6.2 Tiến hành
Trung hịa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đĩ vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hịa.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài này chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu 10 lần) thêm vào đĩ 10ml dung dịch formol ½ đã trung hịa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hồn tồn, sau đĩ định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng.
Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử khơng (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình.
2.2.6.3 Cách tính
Số gam đạm formol cĩ trong 1 lít nguyên liệu = 1.4*V (g/lít) Trong đĩ:
V = V – V0
V0: thể tích NaOH N/10 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/10 mẫu thử thật.
2.2.7 Xác định đạm amoniac[1, 4] 2.2.7.1 Nguyên tắc
Trong nguyên liệu chứa đạm thường cĩ một loại đạm nằm dưới dạng “vơ cơ” (muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin), vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này khơng cần cho cơ thể, nếu cĩ sự hiện diện của nĩ với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất’.
Những loại đạm này thường cĩ tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lơi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đĩ đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này.
2(NH4)+ + Mg(OH)2 ---> 2NH3 + 2H2O + Mg2+ 2NH3 + H2SO4 ----> (NH4)2SO4
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.7.2 Tiến hành
Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng 20 lần (hoặc cân chính xác một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình cầu 500ml, thêm vào đĩ 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải cĩ màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra, lắc đều, đun sơi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam