e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN
CHẾ
Trong quá trình tinh chế enzyme ngồi việc khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn, chúng tơi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau:
Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung dịch bằng nước cất. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha lỗng và các dung dịch khác như sau
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm
1 2
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35.5oC Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sĩng 720nm từ đĩ dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin.
Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau:
Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin. Từ giá trị của x ta tính được hoạt tính protease theo cơng thức:
Hđ P = Tyrosin*V*L t*m*v (UI)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Hđ P: hoạt tính protein (UI)
V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).
t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng mẫu enzyme.
M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế
Các phân đoạn ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml)
Tỉ lệ hoạt tính sau mỗi
giai đoạn tinh chế (%)
Phụ lục
Nhựa khơ ban đầu 0.308 0.012 70.353 9
Phân đoạn pH 5.7 0.264 0.063 66.46 94.47 10 Phân đoạn pH 9.0 0.150 0.035 57.39 81.57 11 Phân đoạn tủa với ammonium
sulfat 0.372
0.185
49.30 70.08 12
Phân đoạn bằng NaCl 0.240 0.074 45.60 64.81 13 Phân đoạn kết tinh 0.115 0.055 36.36 51.68 14 Phân đoạn tái kết tinh 0.097 0.062 36.78 55.34 15
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 66.46 57.39 49.30 45.60 36.36 36.78 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh
Các giai đoạn tinh chế
H o ạ t tí n h p ro te a s e ( U I) Series1
Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế.
Qua bảng số liệu và đồ thị, ta nhận thấy rằng trong quá trình tinh chế enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hoạt tính protein trong mẫu giảm dần. Nguyên nhân cĩ thể là do ban đầu nhựa khơ ngồi chứa enzyme papain ra cịn chứa những enzyme khác cĩ chức năng bảo vệ papain nên hoạt tính cao, sau khi qua những giai đoạn tinh chế tiếp theo đã loại bỏ hầu hết những protein tạp chỉ cịn lại papain tinh khiết nên dẫn đến hoạt tính protein cũng giảm theo. Sau phân đoạn kết tinh, sản phẩm đem đi kết tinh lại thì độ tinh sạch của sản phẩm cao hơn dẫn đến hoạt tính protein tăng lên đơi chút.