e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry
Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều cĩ chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng loại với nhau cĩ hàm lượng các acid amin này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất cĩ màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế ta cĩ thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein.
Hĩa chất
Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hịa tan trong NaOH N/10 thành 100ml.
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hịa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành 100ml.
Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1.
Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin pha với nước cất thành 100ml.
Dựng đƣờng chuẩn
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thường là albumin của bị đã đơng khơ. Tiến hành pha albumin cĩ nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới.
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein mg/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Nước cất (ml) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5
Hút 0.4ml dung dịch protein cĩ nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Sau đĩ vẽ đường chuẩn biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml).
Xác định hàm lƣợng protein cĩ trong mẫu:
Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống nghiệm sạch và đã được sấy khơ. Thêm vào đĩ 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đĩ, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 750nm. Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein cĩ trong mẫu nghiên cứu.