β-caroten là hợp chất của nhúm carotenoid đó được tỡm thấy trong thực phẩm. Cú nhiều nghiờn cứu đó cho rằng, thức ăn giàu carotenoid sẽ làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh như: ung thư, vữa xơ động mạch, lóo húa. Dựa trờn
sự tương quan giữa khẩu phần ăn giàu carotenoid và khả năng làm giảm một số loại bệnh món tớnh β-caroten đó được chứng tỏ là một chất chống oxy húa quan trọng ở người [65], [70]. Theo Zisca và cộng sự (1998), nghiờn cứu can thiệp cú đối chứng, trờn đối tượng phụ nữ 23 - 45 tuổi đó cho thấy, β-caroten
ăn vào với một lượng tương đối thấp là cần thiết để duy trỡ nồng độ MDA ở
mức bỡnh thường [80]. Theo Actis-Goretta L và cộng sự (2004) nghiờn cứu bổ
sung cỏc chất chống oxy húa trong đú cú β-caroten (10mg/ngày) cho thấy, sau 20 ngày bổ sung nồng độ cỏc chất chống oxy húa trong cơ thể tăng lờn, nồng
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1- ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU
2.1.1- Địa điểm và thời gian nghiờn cứu
Địa điểm: Nghiờn cứu được tiến hành tại 2 phường, cú điều kiện kinh tế xó hội gần tương đương nhau.
- Phường Bồ Đề thuộc quận Long Biờn. - Phường Lĩnh Nam thuộc quận Hoàng Mai.
Thời gian nghiờn cứu
- Từ thỏng 10 năm 2009 đến thỏng 6 năm 2010.
2.1.2- Đối tượng tham gia nghiờn cứu Tiờu chuẩn tham gia: Tiờu chuẩn tham gia:
- Tuổi từ 45- 65
- Sống tại địa bàn nghiờn cứu ớt nhất 5 năm - Tự nguyện tham gia nghiờn cứu.
- Nồng độ cholesterol mỏu huyết tương từ 5,2 đến 7,0 mmol/L. - Đường mỏu lỳc đúi < 6,5 mmol/L.
- BMI nằm trong khoảng: 18,5 - 24,9 (kg/m2).
- Chưa hoặc khụng dựng thuốc điều trị RLLPM hai thỏng trước khi nghiờn cứu.
Tiờu chuẩn loại trừ:
- Đối tượng mắc bệnh cấp tớnh tại thời điểm điều tra.
- Đối tượng bịđiếc hoặc dị tật bẩm sinh (gự, vẹo cột sống). - Phụ nữ cú thai và cho con bỳ trong vũng 12 thỏng sau đẻ. - Đó từng cú cơn nhồi mỏu cơ tim.
- Người mắc cỏc bệnh mạn tớnh: Tăng huyết ỏp, đỏi thỏo đường phải điều trị thuốc, ...
2.1.3 Cỡ mẫu và cỏch chọn mẫu
• Cỡ mẫu:
Áp dụng cỡ mẫu kiểm định sự khỏc nhau giữa trung bỡnh cholesterol tổng số trước và sau can thiệp của mỗi nhúm [31].
Theo cụng thức tớnh cỡ mẫu [31]: (Zα + Zβ)2 σ2 n = 2 ( μdc - μdt ) 2 Trong đú: - n: Là cỡ mẫu nghiờn cứu.
- Zα: Là phõn vị chuẩn húa ứng với hệ số tin cậy 95%, α=0,05 thỡ Zα=1.96
- Zβ: Là phõn vị chuẩn húa ứng với độ mạnh của nghiờn cứu 1-β=80%,
β=0,2 thỡ Zβ=0,84
- σ2 : Là phương sai trung bỡnh của cỏ thể ước tớnh là 0,12.
- μdc: Là trị số khỏc biệt giữa trung bỡnh cholesterol sau can thiệp và trước can thiệp của nhúm đối chứng, ước tớnh là 0,1mmol/L, dựa vào kết quả nghiờn cứu của tỏc giả Lờ Thị Hương và cộng sự (2009) [15]. - μdt: Là trị số khỏc biệt giữa trung bỡnh cholesterol sau can thiệp và
trước can thiệp của nhúm can thiệp, ước tớnh là 0,35mmol/L, dựa vào kết quả của nghiờn cứu trước [79].
Từ cụng thức trờn, cỡ mẫu tớnh được cho mỗi nhúm nghiờn cứu là 30
đối tượng/nhúm. Sau khi cộng khoảng 15% đối tượng bỏ cuộc, cỡ mẫu cho mỗi nhúm làm trũn là 35 người. Như vậy, tổng cỡ mẫu cho cả 2 nhúm nghiờn cứu là 70.
• Cỏch chọn mẫu:
Do chọn mẫu cú chủ đớch, chỳng tụi chọn 2 phường cú điều kiện kinh tế- xó hội tương đương nhau để nghiờn cứu. Phường Lĩnh Nam được chọn là phường can thiệp (đối tượng được sử dụng sản phẩm FLAVON SOY kết hợp với tư vấn chế độ ăn). Phường Bồ Đề được chọn là phường chứng (đối tượng chỉđược tư vấn chế độ ăn). Tại mỗi phường, để chọn được 35 đối tượng tham gia nghiờn cứu, chỳng tụi đó dự kiến khỏm sàng lọc khoảng 80 đối tượng/phường (dựa vào tỷ lệ tăng cholesterol đơn thuần tại nội thành Hà Nội là 47,2% theo nghiờn cứu của tỏc giả Nguyễn Thị Lương Hạnh và cộng sự
(2008) [11]), bằng phỏng vấn bộ cõu hỏi sàng lọc, cõn, đo chiều cao, lấy mỏu làm xột nghiệm Glucose và cholesterol huyết tương. Vỡ vậy, tất cả cỏc đối tượng từ 45- 65 tuổi cú nhu cầu tham gia nghiờn cứu tại mỗi phường đều
được tham gia khỏm sàng lọc. Sau khi khỏm sàng lọc, tại mỗi phường, chỳng tụi đó chọn được 35 đối tượng đủ tiờu chuẩn tham gia nghiờn cứu.
2.2- THIẾT KẾ NGHIấN CỨU
Nghiờn cứu can thiệp, cú đối chứng
2.2.1- Sơđồ nghiờn cứu
Theo Hỡnh 2.1 ( trang 27 )
2.2.2- Quy trỡnh nghiờn cứu
Theo như sơ đồ nghiờn cứu ( Hỡnh 2.1 ), tại mỗi phường sau khi khỏm sàng lọc đó chọn được 35 đối tượng/nhúm.
• Thu thập số liệu ban đầu: Hỏi ghi khẩu phần ăn 24h qua. Lấy mỏu làm xột nghiệm cỏc chỉ số húa sinh.
Nhúm can thiệp: Bổ sung bột FLAVON SOY, kết hợp tư vấn chếđộăn. Nhúm chứng: Khụng bổ sung bột FLAVON SOY, chỉ tư vấn chế độăn.
• Cả 2 nhúm đều được hướng dẫn kiểm soỏt chế độ ăn, hạn chế ăn những thực phẩm cú thể làm tăng mỡ mỏu như: Những sản phẩm chế biến sẵn (bỏnh rỏn, quẩy, mỡ tụm, bim bim), rau xalat trộn mayonaire, hoa quả trộn bơ hoặc cream, da của cỏc loại gia cầm, phủ tạng động vật, sườn lợn, cỏc thức ăn xào, rỏn…., trỏnh dầu dừa, bơ. Khẩu phần ăn khống chế trong khoảng 1800 - 2000 Kcal. Cú thực đơn tham khảo kốm theo (Phụ lục).
• Cỏc đối tượng trong nhúm can thiệp được uống bổ sung bột FLAVON SOY liờn tục trong vũng 9 tuần. Mỗi đối tượng được yờu cầu uống 1 tỳi bột FLAVON SOY (20g/gúi) mỗi ngày pha trong 150 ml nước ấm khuấy đều vào 1 giờ nhất định.
• Khẩu phần ăn và việc sử dụng bột FLAVON SOY của đối tượng được cỏn bộ viện Dinh dưỡng giỏm sỏt hàng tuần.
• Hiệu quả giảm RLLPM và tăng khả năng chống oxy húa mỏu được
đỏnh giỏ qua sự thay đổi về nồng độ cholesterol tổng số, triglycerid, HDL-C, LDL-C, MDA (Malonyldialdehyd) và TAS (Total antioxidant status: trạng thỏi chống oxy húa toàn phần) tại thời điểm trước can thiệp (T0) và sau 9 tuần can thiệp (T9).
2.2.3- Thành phần và liều lượng của bột FLAVON SOY
• Bột FLAVON SOY được chiết suất từ bột Đậu tương nảy mầm và bột cà rốt, được đúng gúi thành những gúi nhỏ, cú khối lượng 20g, trong bao bỡ Ny/Al/PE. Với mỗi gúi 20g chứa 72mg isoflavon và 2,5mg
β-caroten.
Bảng 2.1: Thành phần và tớnh chất bột FLAVON SOY Thành phần và tớnh chất Đơn vị Hàm lượng Isoflavon mg/100g 359,4 β-caroten mg/100g 12,0 Protein g % 36,1 Lipid g% 17,7 Glucid g% 41,03 Màu Vàng nhạt Mựi Thơm ngọt Trạng thỏi Bột, xốp, tơi, mịn Tro tổng số % 1,12
Tro khụng tan trong HCl % 0,15
Chỡ mg/kg 0,02 Kẽm mg/kg 15,42 Đồng mg/kg 1,02 Asen mg/kg < 0,01 Thủy ngõn mg/kg < 0,002 Cadimi mg/kg < 0,01
Khỏm sàng lọc khoảng 80 người/phường:
xột nghiệm Glucose, TC, phỏng vấn và cõn, đo nhõn trắc
35 người bổ sung FLVON SOY kết hợp kiểm soỏt chế độăn cú
giỏm sỏt (9 tuần)
35 người kiểm soỏt chế độăn cú giỏm sỏt ( 9 tuần)
Hỡnh 2.1: Sơđồ nghiờn cứu 35 người đủ tiờu chuẩn
Chọn 2 phường Kết quả ( n=34 ) Kết quả ( n=30 ) Kết luận So sỏnh
1 phường can thiệp 1 phường chứng
Thu thập số liệu ban đầu: - XN cỏc chỉ số Húa sinh - Hỏi ghi khẩu phần ăn
Đỏnh giỏ sau can thiệp: XN cỏc chỉ số Húa sinh Phỏng vấn, hỏi ghi khẩu phần, cõn trọng lượng cơ thể
2.3- PHƯƠNG PHÁP & KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIấN CỨU 2.3.1- Phương phỏp thu thập số liệu 2.3.1- Phương phỏp thu thập số liệu
• Cõn đo cỏc chỉ tiờu nhõn trắc:
- Cõn nặng: sử dụng cõn SECA với độ chớnh xỏc 0,1 kg.
- Đo chiều cao: đo bằng thước gỗ 3 mảnh của UNICEF, với độ chớnh xỏc 0,1 cm.
- Tớnh chỉ số khối cơ thể (BMI - Body Mass Index):
Cõn nặng (kg) BMI =
Chiều cao2 (m)
Đỏnh giỏ tỡnh trạng dinh dưỡng: Dựa theo cỏch phõn loại của WHO (2000) như sau [77]:
- Thiếu dinh dưỡng trường diễn : BMI (kg/m2) ≤ 18,5 - Bỡnh thường : 18,5 < BMI (kg/m2) ≤ 24,9 - Thừa cõn : BMI (kg/m2) ≥ 25,0 - Tiền bộo phỡ : 25,0 < BMI (kg/m2) ≤ 29,9 - Bộo phỡ độ I : 30,0 < BMI (kg/m2) ≤ 34,9 - Bộo phỡ độ II : 35,0 < BMI (kg/m2) < 39,9 - Bộo phỡ độ III : BMI (kg/m2) ≥ 40,0 • Phỏng vấn trực tiếp:
- Cỏc thụng tin chung của đối tượng được thu thập theo bộ cõu hỏi thiết kế sẵn (phụ lục).
- Điều tra khẩu phần ăn bằng phương phỏp hỏi ghi 24 giờ qua. Cụng cụ là bộ cõu hỏi thiết kế sẵn (phụ lục). Sử dụng bảng quy đổi chuẩn thức của Viện Dinh Dưỡng sau đú sử dụng bảng thành phần thức ăn Việt Nam năm 2007 để tớnh ra giỏ trị dinh dưỡng của khẩu phần [3]. Phương phỏp hỏi ghi 24 giờ qua: Đối tượng kể lại tỉ mỉ những gỡ đó ăn
ngày hụm trước khi phỏng vấn. Sử dụng Album cỏc mún ăn thụng dụng của Viện Dinh Dưỡng để giỳp đối tượng nhớ lại, trả lời một cỏch chớnh xỏc trong khi phỏng vấn [17].
• Xột nghiệm húa sinh mỏu:
- Lấy bệnh phẩm: Lấy 4ml mỏu tĩnh mạch khi đúi (đối tượng nhịn đúi ớt nhất 10 tiếng đồng hồ, tốt nhất là qua đờm, nhưng khụng quỏ 16 tiếng và được nghỉ ngơi ớt nhất 10 phỳt trước khi lấy mỏu. Cỏc đối tượng đang sốt hoặc quỏ sợ hói đều khụng lấy mỏu). Sau khi ly tõm và tỏch huyết tương, bệnh phẩm thu được sẽ bảo quản ở nhiệt độ -250C cho đến khi phõn tớch.
- Định lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C, LDL-C, Malonyl dialdehyd (MDA) và trạng thỏi chống oxy húa toàn phần (Total antioxidant status: TAS).
2.3.2- Phương phỏp định lượng cỏc chỉ số húa sinh
Định lượng cholesterol toàn phần, tryglycerid, HDL-C, LDL-C bằng phương phỏp enzym so màu trờn mỏy phõn tớch húa sinh tự động Biolis 24i (Nhật Bản). Tại khoa Húa sinh Viện Dinh dưỡng
2.3.2.1- Định lượng Cholesterol toàn phần
Theo phương phỏp “CHOD - PAP” Nguyờn lý [45], [40]:
Cholesterol este + H2O Cholesterol + Acid bộo Cholesterol + O2 Cholesterol-3-one + H2O2 2H2O2 + 4-Aminoantipyrine + Phenol Quinoneimine + 4 H2O
Cholesterol esterase
Cholesterol oxidase
2.3.2.2-Định lượng Tryglycerid
Theo phương phỏp đo màu sử dụng Glycerol-3-Phosphate-Oxidase (GPO) Nguyờn lý:
Triglycerides Glycerol + Acid bộo
Glycerol + ATP Glycerol- 3-phosphat + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihydroxyaceton phosphat + H2O2 2H2O2 + Aminoantipyrine + 4-Chlorophenol Quinoneimine + HCl
+4H2O
2.3.2.3- Định lượng HDL-C [53]
Xột nghiệm gồm 2 bước:
Bước thứ nhất, sự loại bỏ chylomicron,VLDL- cholesterol, và LDL-C nhờ enzym cholesterol esterase và cholesterol oxidase.
Enzym oxidase bị cắt bỏ nhờ enzym catalase để tạo nờn Peroxidase. Cholesterol este + Cholesterol esterase Cholesterol + Acid bộo Cholesterol + O2 + Cholesterol oxidase Cholestenone + H2O2
Bước thứ hai, sự định lượng đặc hiệu của HDL-C sau sự giải phúng của HDL-C bởi sự cú mặt của surfactant trong thuốc thử. Độ đậm đặc của thuốc nhuộm mầu quinone được tạo ra trong phản ứng Trinder tỷ lệ thuận trực tiếp với nồng độ cholesterol khi đo ở bước súng 596 nm.
Cholesterol este + Cholesterol esterase Cholesterol + Acid bộo Cholesterol + O2 + Cholesterol oxidase Cholestenone + H2O2 H2O2 + 4-aminoantipyrine + HDAOS + peroxidase Sắc tố quinone
+ 4H2O
(trong đú HDAOS là N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline).
Lipoprotein lipase Glycerokinase
GPO
2.3.2.4- Định lượng LDL-C [64]
Xột nghiệm gồm 2 bước:
Bước thứ nhất, sự loại bỏ chylomicron,VLDL-cholesterol, và HDL-C nhờ enzym cholesterol esterase và cholesterol oxidase.
Enzym oxidase bị cắt bỏ bởi hoạt động của enzym catalase để tạo nờn Peroxidase.
Cholesterol este + Cholesterol esterase Cholesterol + Acid bộo Cholesterol + O2 + Cholesterol oxidase Cholestenone + H2O2
Bước thứ hai, sự định lượng đặc hiệu của LDL-C sau sự giải phúng nhờ sự cú mặt của surfactant đặc hiệu cho LDL - C cú trong thuốc thử. Độ đậm đặc của thuốc nhuộm mầu quinone được tạo ra trong phản ứng Trinder tỷ
lệ thuận trực tiếp với nồng độ cholesterol khi đo ở bước súng 596 nm.
Cholesterol este + Cholesterol esterase Cholesterol + Acid bộo Cholesterol + O2 + Cholesterol oxidase Cholestenone + H2O2 H2O2 + 4-aminoantipyrine + TOOS + peroxidase Sắc tố quinone + 4H2O
(trong đú TOOS là N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopro pyl)-3-methylaniline).
2.3.2.5- Định lượng MDA huyết tương [41]
Nguyờn tắc: MDA phản ứng với Thiobarbituric acid để tạo thành phức Trimethine cú màu hồng. Phức hợp này cú đỉnh hấp thụ tối đa ở 532 nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng MDA. Xột nghiệm được thực hiện tại bộ mụn Húa sinh Trường Đại học Y Hà Nội.
- Tiến hành:
Ống thử: Huyết tương: 500 μL
Dung dịch TBA, TCA, HCl/BHT: 2000 μL. Dung dịch SDS 8,1%: 100 μL.
Ống trắng: Thay huyết tương bằng nước cất 500 μL.
Đun sụi cỏch thuỷ 2 ống nghiệm trong 30 phỳt, sau đú làm lạnh. Phức hợp màu được chiết suất bằng 2ml n-butanol.
Đo mật độ quang học ở bước súng 532nm.
Nồng độ MDA huyết tương được tớnh dựa vào hệ số tắt phõn tử của MDA là 1,54 x 105M-1cm-1.
2.3.2.6- Định lượng TAS huyết tương
Nồng độ TAS huyết tương được xỏc định bởi kit của Randox Laboratoies Ltd UK (Cat No. NX 2332). Xột nghiệm được thực hiện trờn mỏy AU- 400 tại Khoa Húa sinh Bệnh viện Nhi Trung Ương.
Nguyờn lý:
ABTSđ (2,2-azino-di[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]) được ủ với metmyoglobin (là một peroxidase) và H2O2 để tạo gốc cation ABTSđ*+. Chất này cho màu xanh da trời và được đo ở bước súng 600nm. Cỏc chất chống oxy húa cú trong huyết tương là nguyờn nhõn ức chế sự tạo thành sản phẩm màu và độ ức chế tỷ lệ với hợp chất màu được tạo ra.
HX - Fe3+ + H2O2 X - [Fe4+ = O] + H2O ABTSđ + X - [Fe4+ = O] ABTSđ*+ + HX - Fe3+
HX - Fe3+ : Metmyoglobin X - [Fe4+ = O]: Ferrylmyoglobin
2.4- Xử lý và phõn tớch số liệu
Số liệu được nhập bằng phần mềm Epi-Info 6.04, Excell và Access.
Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 17.0. Trước khi sử dụng cỏc phộp phõn tớch thống kờ, số liệu đó được kiểm tra xem cú phõn bố chuẩn hay khụng. Với những biến phõn bố khụng chuẩn, phộp biến đổi Log đă được sử
dụng để hiệu chỉnh. Phộp phõn tớch T-test hoặc Mann-Whitney giữa 2 mẫu
độc lập được sử dụng để so sỏnh giỏ trị trung bỡnh giữa nhúm sử dụng FLAVON SOY và nhúm chứng. Phộp phõn tớch T-test ghộp cặp hoặc Wilcoxon được sử dụng để so sỏnh hiệu quả trước và sau can thiệp trờn cựng một nhúm nghiờn cứu. Với biến định tớnh, test Chi-bỡnh phương được sử dụng
2.5- Vấn đềđạo đức trong nghiờn cứu:
Trước khi tiến hành nghiờn cứu, Đề cương nghiờn cứu đó được Hội
đồng đạo đức trong nghiờn cứu Y sinh học Viện Dinh dưỡng chấp thuận, theo quyết định số: 1120/VDD - QLKH, ký ngày 09/10/2009 (phụ lục).
Cỏc đối tượng mời tham gia nghiờn cứu được giải thớch rừ ràng về mục
đớch, ý nghĩa của việc nghiờn cứu. Cỏc nội dung nghiờn cứu được tiến hành khi được sự đồng ý tự nguyện tham gia của đối tượng và sau khi đối tượng đó ký giấy chấp thuận tỡnh nguyện tham gia nghiờn cứu. Cỏc kết quả xột nghiệm mỏu, và cỏc chỉ số nhõn trắc đều được thụng bỏo đầy đủ cho cỏc đối tượng. Cỏc xột nghiệm hoỏ sinh mỏu được tiến hành đảm bảo nguyờn tắc vụ trựng, an toàn cho đối tượng. Đối tượng khụng phải trả bất cứ một chi phớ nào và
được bồi dưỡng sau khi lấy mỏu xột nghiệm.
Đối tượng được quyền từ chối tham gia nghiờn cứu bất cứ khi nào hoặc cú thể ngừng ở bất cứ giai đoạn nào của nghiờn cứu.
Số liệu liờn quan đến đối tượng nghiờn cứu được lưu giữ bảo mật. Kết quả nghiờn cứu chỉ phục vụ cho mục đớch nghiờn cứu, khụng sử dụng cho mục đớch khỏc.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 3.1- Đặc điểm chung của đối tượng nghiờn cứu