- Tiờu chuẩn lựa chọn
2.4.3. Nội dung và cỏc bước tiến hành
2.4.3.1. Nghiờn cứu một số đặc điểm dịch tễ và lõm sàng bệnh bạch biến
- Tiến hành thu thập cỏc số liệu cần thiết trờn tất cả 150 bệnh nhõn bạch biến được khỏm bệnh và điều trị nội ngoại trỳ tại khoa Da liễu, Bệnh viện Trung ương Quõn đội 108 vào phiếu đăng ký theo dừi bệnh nhõn bạch biến
Bệnh nhân bạch biến (n=150)
Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, lâm sàng (n=150)
Nghiên cứu miễn dịch trên bệnh nhân bạch biến thể lan toả giai đoạn hoạt
động (n=32) Mức độ thâm nhiễm các tế bào TCD3, TCD4, TCD8 tại mô tổn th-ơng (n=32) Ng-ời khỏe mạnh (n=32) Mức độ thâm nhiễm các tế bào TCD3, TCD4, TCD8 tại mô không tổn th-ơng (n=32) Định l-ợng các tế bào TCD3, TCD4, TCD8 trong máu (n=32) Định l-ợng các tế bào TCD3, TCD4, TCD8 trong máu (n=32)
(mẫu phiếu ở phần phụ lục đó được hội đồng chấm đề cương thụng qua) theo cỏc mục sau:
+ Tuổi, giới.
+ Tiền sử bản thõn liờn quan yếu tố chấn thương tõm lý và mắc bệnh kết hợp, tiền sử gia đỡnh cựng mắc bệnh bạch biến.
+ Thời gian khởi phỏt bệnh bạch biến.
+ Khoảng thời gian từ khi bắt đầu bị tổn thương đầu tiờn đến khi xuất hiện tổn thương tiếp theo.
+ Vị trớ tổn thương đầu tiờn và hiện tại, diện tớch tổn thương hiện tại (tớnh theo đơn vị là một bàn tay = 1% diện tớch cơ thể).
+ Chẩn đoỏn bệnh và thể bệnh, giai đoạn bệnh (xỏc định chỉ số hoạt động của bệnh bạch biến: chỉ số VIDA) theo cỏc thang điểm đó được trỡnh bày ở mục 1.6.3. Theo thang điểm của chỉ số này, bệnh ở giai đoạn ổn định khi chỉ số VIDA = -1 đến 0 và ở giai đoạn hoạt động khi chỉ số VIDA = +1 đến +4.
2.4.3.2. Nghiờn cứu số lượng và tỷ lệ cỏc tế bào lympho TCD3, TCD4, TCD8 trong mỏu ngoại vi ở bệnh nhõn bạch biến thể lan toả, giai đoạn hoạt động và ở nhúm chứng
- Phương phỏp: đếm tế bào dũng chảy (flowcytometry).
- Nguyờn lý: dựa theo nguyờn lý miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Cỏc tế bào TCD3, TCD4, TCD8 sau khi ủ với khỏng thể chống CD3, chống CD4 và chống CD8 đó gắn huỳnh quang với cỏc màu tương ứng được đi qua một kim phun cực nhỏ dưới tỏc động của chựm tia laser, cỏc tế bào sẽ phỏt sỏng. Cỏc detector nhận biết, đếm và xử lý để cho kết quả.
+ Thiết bị: mỏy FACS Count của hóng Becton-Dickinson (Hoa kỳ) sản xuất. + Sinh phẩm: cỏc sinh phẩm gồm thuốc thử, cỏc control, chất dừng phản ứng, nước rửa đều do hóng Becton-Dickinson (Hoa kỳ) sản xuất.
- Cỏc bước tiến hành
Lấy 2 ml mỏu tĩnh mạch cú chống đụng của mỗi một đối tượng nghiờn cứu ở nhúm bệnh và nhúm chứng.
* Qui trỡnh kỹ thuật
+ Mỗi lần xột nghiệm cần làm control với 4 ống zero, low, medium, high. Sau đú làm cỏc mẫu bệnh nhõn theo cỏc bước sau:
+ Đỏnh số cỏc mẫu bệnh nhõn theo thứ tự.
+ Trộn cỏc cặp sinh phẩm ngược chiều trong 5 giõy.
+ Trộn cỏc cặp sinh phẩm thuận chiều trong 5 giõy.
+ Mở cỏc cặp sinh phẩm bằng dụng cụ chuyờn dụng (coring station).
+ Trộn đều mẫu mỏu bệnh nhõn bằng cỏch ỳp ngược ống mỏu 5 lần.
+ Nhỏ 50 l mỏu toàn phần vào mỗi ống TCD4, TCD3 và ống TCD8, TCD3 (riờng 4 ống control dựng mỏu của một người khoẻ mạnh).
+ Đậy nắp và trộn (vortex) trong 5 giõy.
+ Ủ ở nhiệt độ phũng (20-25 độ C) trong thời gian từ 60 - 120 phút.
+ Mở nắp, nhỏ tiếp vào mỗi ống 50 l dung dịch cố định (fixative solution).
+ Trộn (vortex) trong 5 giõy.
+ Ủ ở nhiệt độ phũng trong 30 phút.
Đọc kết quả trong vũng 24 giờ trờn mỏy FACS Count. Trước khi đọc phải trộn đều mẫu (vortex) trong 5 giõy. Đọc theo thứ tự cỏc ống control (zero, low, medium, high) trước, sau đú đọc cỏc mẫu theo thứ tự ghi trờn cỏc cặp xột nghiệm. Sau khi đọc xong cỏc ống TCD4, TCD8, TCD3 mỏy sẽ tớnh toỏn bao gồm cỏc thụng số TCD4, TCD8, TCD3, TCD4/TCD3, TCD8/TCD3. Để đảm bảo tớnh chớnh xỏc của xột nghiệm, trước khi cho kết quả mỏy thực hiện qui trỡnh tự kiểm tra đối với mẫu xột nghiệm bằng cỏch so sỏnh số lượng TCD3 ở hai ống. Nếu sự khỏc biệt < 4% thỡ mỏy sẽ cho in kết quả. Nếu sự khỏc biệt > 4% mỏy sẽ huỷ kết quả, bỏo lỗi kỹ thuật và yờu cầu xột nghiệm lại.
2.4.3.3. Nghiờn cứu thõm nhiễm cỏc tế bào lympho TCD3, TCD4 và TCD8 tại mụ da tổn thương và khụng tổn thương ở bệnh nhõn bạch biến thể lan toả, giai đoạn hoạt động
- Sinh thiết da
+ Vị trớ sinh thiết: trờn cựng một bệnh nhõn được lấy sinh thiết hai vị trớ là vựng da tổn thương và vựng da khụng tổn thương.
Vựng da tổn thương: chỳng tụi tiến hành sinh thiết trong vựng da cú thương tổn và sỏt bờ viền của tổn thương.
Vựng da khụng tổn thương: chỳng tụi tiến hành sinh thiết tại vị trớ da khụng cú tổn thương cỏch bờ viền tổn thương khoảng 5 cm.
Chỗ cắt sinh thiết mô da trong tổn th-ơng
Chỗ cắt sinh thiết mô da không tổn th-ơng
5 cm Dát tổn th-ơng bạch biến
+ Kỹ thuật sinh thiết
Gõy tờ tại chỗ cần sinh thiết da bằng dung dịch novocain 3%.
Dựng dụng cụ sinh thiết chuyờn dụng cú tờn “punch biopsy” cắt miếng da cần sinh thiết.
Miếng da cú hỡnh trũn đường kớnh khoảng 1,5 - 2 mm hoặc to hơn tuỳ theo kớch thước của dụng cụ.
Bảo quản bệnh phẩm trong dung dịch formol 10%.
- Nhuộm hoỏ mụ miễn dịch
Sử dụng phương phỏp ABC (Avidin- Biotin- Complex) và dựng khỏng thể đơn clụn chống CD3, CD4 và CD8 của hóng Dako, pha loóng 1/50 để xỏc định TCD4, TCD8, TCD3. Kỹ thuật được tiến hành tại khoa Giải phẫu bệnh- tế bào, Bệnh viện K Hà Nội.
+ Nguyờn lý kỹ thuật húa mụ miễn dịch BBộộc lc lộộ ––Kết hKết hợợp p ––Khuyếch Khuyếch đạđạii
Kh Khááng thng thểểIIII g gắắn biotinn biotin Kh Khááng thng thểểII Kh Khááng nguyng nguyêênn Biotin Biotin Avidin Avidin Men Men B Bệệnh phnh phẩẩm m đ-đ-ợợc cc cốốđđịnh formolịnh formol
Sơ đồ 2.1. Nguyờn lý kỹ thuật húa mụ miễn dịch sử dụng phương phỏp ABC (Avidin- Biotin- Complex)
+ Cỏc sinh phẩm
* Bệnh phẩm đỳc trong paraffin.
* Khỏng thể đơn clụn chống CD3, CD4, CD8.
* Khỏng thể cầu nối gắn biotin.
* Phức hợp avidin- peroxidase.
* Cơ chất cho phản ứng tạo tủa mầu xỳc tỏc bởi peroxidase.
* Cỏc hoỏ chất cần thiết khỏc. + Cỏc bước tiến hành
* Chuẩn bị lam kớnh (nhỳng dung dịch Silane trong 5 phút).
* Cắt lỏt mỏng 3- 4 m (3 tiờu bản cho mỗi trường hợp). Dỏn tiờu bản bằng nước. Để tủ ấm 56 độ qua một đờm.
* Tẩy paraffin với toluene, ngõm qua cồn, rồi rửa bằng nước cất 2 lần, mỗi lần 5 phút.
* Bộc lộ khỏng nguyờn bằng nhiệt (đun cỏch thuỷ trong dung dịch đệm citrate pH= 6 trong nồi ỏp suất trong 5 phút).
* Để nguội trong 20 phút.
* Rửa nước cất.
* Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 3% trong 5 phút.
* Rửa nước cất.
* Phủ khỏng thể 1 (MO A-H CD3, MO A-H CD4 và MO A-H CD8) để 60 phút.
* Rửa tiờu bản bằng dung dịch TBS.
* Phủ khỏng thể 2 (RB A-MO Ig/Biotin) trong 30 phút.
* Rửa tiờu bản bằng dung dịch TBS.
* Phủ phức hợp Avidin- Peroxidase (Avidin- HRP Complex) trong 30 phút.
* Rửa tiờu bản bằng dung dịch TBS.
* Phủ dung dịch Diamino Benzidine (DAB) trong 10 phút.
* Rửa nước chảy 5 phút.
* Nhuộm nhõn bằng hematoxyline (30 giõy).
* Khử nước, làm sạch tiờu bản rồi đọc kết quả trờn kớnh hiển vi quang học.
+ Cỏch đỏnh giỏ: cỏc tế bào được coi là dương tớnh khi màng bào tương
bắt màu nõu rừ rệt. Phõn mức độ theo Ahn S.K và cộng sự qui định như sau [19]
(-): tiờu bản nhuộm õm tớnh.
(0): từ 1 đến 2% tế bào nhuộm dương tớnh. (±): từ 3 đến 5% tế bào nhuộm dương tớnh.
(+): từ 6 đến 25% tế bào nhuộm dương tớnh.
(++): từ 26 đến 50% tế bào nhuộm dương tớnh.
(+++): từ 51đến 75% tế bào nhuộm dương tớnh.