2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng
Chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở 20 ÷ 30oC, lắc 180 vòng/phút. Tiến hành lấy mẫu lúc đầu và sau 3h nuôi cấy để xây dụng đường cong sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục (∆OD600 nm).
Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 500 ÷ 610 nm.
Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy Lactobacillus bằng máy quang phổ UV-VIS. Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 600 nm, đưa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy Lactobacillus cho vào cuvet số 2 và cho vào máy đo, đọc kết quả hiện trên màn hình.
2.3.3.2. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10%. Tiến hành nuôi cấy hai chủng Lactobacillus ở các nhiệt độ 30o, 33o, 37o, 40oC. Cứ sau 12 giờ và 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo pH và OD600 nm.
2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Sau khi chọn được nhiệt độ thích hợp cho từng chủng Lactobacillus ta tiến hành thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thu sinh khối tối ưu cho từng chủng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm khoảng 2/3 bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10%. Tiến hành đo pH và OD600 nm sau 0, 8, 12, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 giờ nuôi cấy.
2.3.3.4. Xác định pH thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng với lượng môi trường khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy. Chỉnh pH môi trường về các giá trị pH = 4, 5, 6, 7, 8 và cho 10 % giống vào nuôi cấy ở nhiệt độ và pH thích hợp đã được chọn. Tiến hành đo pH và OD600 nm sau 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32h nuôi cấy.
2.3.3.5. Xác định tốc độ khuấy trộn thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng với lượng môi trường khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy, pH =6.8 ± 0.2, ở nhiệt độ 34oC, ở các tốc đô lắc 0, 100, 140, 180, 220 vòng/phút. Tiến hành đo pH và OD600 nm sau 4h nuôi cấy, thời gian nuôi 30h.
2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic
2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa
Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng, lắc 180 vòng/phút,
sau 16 – 24h tiến hành thu dịch lọc bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với enzyme protease và tinh bột với enzyme amylase). Chuẩn bị môi trường trong nước cất rồi phân phối vào đĩa peptri. Sau khi thạch đông, khoét những lỗ nhỏ đường kính 0,5 cm trên mặt thạch, cho vào 0,1 ml dung dịch lọc, giữ trong tủ ấm. Sau 24 h đổ lugol và đo đường kính phần môi trường trong suốt không bắt màu với lugol. Biểu diễn hoạt tính tương đối của enzyme bằng số mm đường kính vòng thủy phân.
Hoạt tính tương đối enzyme (H) xác định theo công thức: H = D – d (cm) Trong đó :
D: Đường kính vòng phân giải cộng đường kính lỗ khoan. d: Đường kính lỗ khoan.
2.3.4.2. Xác định khả năng chịu mặn
Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở các nồng độ
muối NaCl từ 1÷5%, lắc ở tốc độ 180 vòng/phút, nhiệt độ 37oC trong thời gian 24h. Kiểm tra khả năng phát triển của hai chủng Lactobacillus bằng giá trị OD600 nm.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus
3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng
Các cá thể cá chim vây vàng khỏe mạnh, đã trải qua một số đợt dịch bệnh được lấy từ trại cá Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán (Nha Trang – Khánh Hòa). Toàn bộ nội tạng của cá chim được tách ra để làm đối tượng phân lập
Lactobacillus. Tiến hành phân lập và thuần khiết Lactobacillus trên môi trường
MRS, ở nhiệt độ 37oC. Kết quả đã phân lập và thuần khiết được 11 chủng
Lactobacillus và đặt tên theo thứ tự L1.1, L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L2.1, L2.2, L2.3,
L2.4, L2.5, L2.6.
3.1.2. Tuyển chọn chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio
Tiến hành tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio : Các chủng Vibrio có ký hiệu lần lượt là V2.1, V2.2, V2.3, V2.4, C1, C7, C23 được lấy từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm và phân lập trên chính cá chim vây vàng. Trong đó: V2.1 và V2.2 thuộc loài V. parahaemolyticus, V2.3 và V2.4 thuộc loài V.
harveyi, C1, C7, C23 thuộc loài V. chorela.
Các chủng Lactobacillus phân lập được ở trên, được nuôi trên môi trường MRS lỏng, lắc với tốc độ 180 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 ÷ 30oC). Các chủng
Vibrio được tiến hành đồng thời, nuôi trên môi trường APW, lắc 150 vòng/phút, ở
nhiệt độ phòng (28 ÷ 30oC). Tiến hành thử hoạt tính kháng Vibrio của Lactobacillus
saukhi các chủng Lactobacillusvà Vibrio đã được nuôi khoảng 18 ÷ 22 giờ. Trang đều 0,1ml chủng Vibrio lên bề mặt đĩa thạch LB, đục các lỗ có đường kính 5 mm lên môi trường đã cấy Vibrio và cho 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus
vào lỗ thạch. Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 37oC trong tủ ấm.
Tính đối kháng của các chủng Lactobacillus được đánh giá thông qua kích thước vòng kháng khuẩn (D – d, mm), trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính lỗ thạch. Sau 1 ÷ 2 ngày nuôi cấy, các đĩa nuôi cấy được đem ra
đọc kết quả. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng Vibrio của các chủng
Lactobaccillus mới phân lập được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng kháng Vibrio của Lactobacillus
D – d (mm) Đường kính Chủng V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23 L 1.1 7 6 7.5 0 0 4.5 8.5 L 1.2 11 10 16 14 11 18 16 L 1.3 14 12 10 18 12 19 17 L 1.4 7.5 12 9 8 7.5 9.5 13 L 1.5 8.5 10.5 12.5 8 8 7 14.5 L 2.1 8 13 7 0 0 0 9 L 2.2 9 10 12 8.5 9 10.5 6.5 L 2.3 0 0 2 3.5 0 2.5 5 L 2.4 6 7.5 0 0 5.5 6 4.5 L 2.5 0 5 8 6.5 0 0 5.5 L 2.6 0 0 0 0 0 0 0
Kết quả nghiên cứu cho thấy: Trong 11 chủng Lactobacillus phân lập được, 10 chủng có hoạt tính kháng Vibrio, trong đó chỉ có 5 chủng (L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L2.1) có khả năng kháng được cả 7 chủng Vibrio, chiếm 45,45%. Các chủng
Lactobacillus còn lại gồm (L1.1, L2.1, L2.3, L2.4, L25) chỉ có hoạt tính kháng với
2 ÷ 4 chủng Vibrio. Chủng L2.6 không có khả năng kháng Vibrio. Như vậy, các chủng Lactobacillus khác nhau thì khả năng kháng Vibrio khác nhau.
0 5 10 15 20 L 1.2 L 1.3 L 1.4 L 1.5 L 2.2 Chủng Lactobacillus H o ạ t tí n h k h á n g V ib ri o D - d (m m ) V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23
Hình 3.1. Khả năng kháng Vibrio của một số chủng Lactobacillus
Trong 5 chủng Lactobacillus có khả năng kháng Vibrio tốt nêu trên có hai chủng là Lactobacillus L1.2 và L1.3 có khả năng kháng Vibrio mạnh nhất, chúng có thể kháng được nhiều chủng Vibrio khác nhau, với đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất, khoảng 13 ÷ 14 mm. Kết quả này tương đồng với kết quả của W.Charernjiratragul và cộng sư (2008) khi nghiên cứu hoạt động kìm hãm của chủng Lactobacillus PSU – LAB71 đối với 3 chủng Vibrio (V.Chorela O1,
V.Chorela O139, V.Parahaemolyticus) bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa
thạch. Kết quả đường kính trung bình của vòng kháng khuẩn thu được trên các đĩa thạch cũng nằm trong khoảng 12 ÷ 14 mm.
Đặc tính kháng Vibrio là đặc một đặc tính rất quan trọng bởi Vibrio là một trong những đối tượng vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên cá chim. Thông qua thí nghiệm này có thể thấy rằng có thể sử dụng các chủng Lactobacillus ở trên để sản xuất chế phẩm probiotic cho cá chim với mục đích kháng vi khuẩn gây bệnh vibriosis.
Từ những căn cứ ở trên chúng tôi chọn hai chủng L1.2 và L1.3 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng L1.2 và L1.3 và L1.3
3.2.1. Đặc điểm hình thái
3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2
Chủng L1.2 được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, nuôi trong tủ ấm 37oC. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc chủng L1.2
Kết quả cho thấy: chủng L1.2 có khuẩn lạc tròn, có đỉnh nhọn, màu trắng nhạt, có kích thước khoảng 2mm sau 24 giờ nuôi cấy.
Khi làm tiêu bản soi tươi và nhuộm gram quan sát hình thái tế bào của chủng L1.2, kết quả trên hình 3.4 và hình 3.5: tế bào có dạng hình que, đứng đơn, xếp chuỗi, tụ thành đám, kích thước khoảng 2.5 ÷ 3µm. Tế bào bắt màu tím của thuốc nhuộm gram, điều đó chứng tỏ chủng L1.2 là trực khuẩn, gram dương.
Hình 3.3. Hình ảnh tế bào chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X
Hình 3.4. Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.2
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng L1.3
Chủng L1.3 được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, nuôi trong tủ ấm 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc chủng L1.3
Kết quả cho thấy chủng L1.3 có khuẩn lạc tròn, có màu trắng đục sữa, bề mặt trơn bóng, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy khoảng 2,2 mm.
Khi làm tiêu bản soi tươi và nhuộm gram quan sát hình thái tế bào của chủng L1.3, kết quả trên hình 3.7 và hình 3.8: tế bào có dạng hình que, đứng đơn, xếp chuỗi, tụ thành đám, kích thước khoảng 2-3µm. Tế bào bắt màu tím của thuốc nhuộm Gram, điều đó chứng tỏ chủng L1.3 là trực khuẩn, gram dương.
Hình 3.6. Hình ảnh tế bào chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X
Hình 3.7. Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 L1.3
3.2.2. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của hai chủng L1.2 và L1.3
Tiến hành xác định các đặc tính sinh lý sinh hóa của hai chủng L1.2 và L1.3 bao gồm: khả năng di động, khả năng sinh axit lactic, khả năng sinh enzyme catalase, khả năng lên men các loại đường. Xác định khả năng di động bằng phương pháp cấy đâm sâu trên môi trường thạch đứng. Thử khả năng sinh axit lactic bằng phương pháp cho tạo phức với phenol. Thử khả năng sinh enzyme catalase bằng cách nhỏ H2O2 vào khuẩn lạc, không thấy sủi bọt là catalase âm tính. Xác định khả năng lên men các loại đường trên môi trường cơ bản chứa 1% các loại đường tương ứng bao gồm glucose, mantose, manitol, sorbitol, sucrose, lactose.
Kết quả xác định các đặc tính sinh lý, sinh hóa của hai chủng L1.2 và L1.3 được thể hiện hình 3.8, hình 3.9 và bảng 3.2.
Hình 3.8. Hình ảnh xác định khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3
Hình 3.9. Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3 (1- glucose; 2- mantose; 3- manitol; 4- sorbitol; 5- sucrose; 6- lactose) Bảng 3.2. Kết quả xác định các đặc tính sinh hóa của hai chủng L1.2 và L1.3
Chủng Đặc tính
L1.2 L1.3
Khả năng sinh axit lactic + +
Nhuộm Gram + +
Khả năng di động _ _
Khả năng sinh catalase _ _
Khả năng tạo bào tử _ _
Khả năng sử dụng các loại đường
Glucose + + Mantose + + Manitol + + Sorbitol _ + Sucrose + + Lactose + + Tinh bột _ _ L1.2 L1.3
Kết quả thí nghiệm cho thấy L1.2 và L1.3: là những vi khuẩn có sinh axit lactic, gram dương, catalase âm tính, không di động, không tạo bào tử và có khả năng lên men đường lactose và một số đường khác (chủng L1.3 có khă năng lên men được cả 6 loại đường nêu trên, chủng L1.2 chỉ lên men được 5 loại đường, ngoại trừ sorbitol). Theo khóa phân loại Bergey có thể kết luận 2 chủng L1.2 và L1.3 đều là những vi khuẩn lactic.
3.3. Xác định các đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic của chủng L1.2 và L1.3 3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3 3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Việc xác định đường cong sinh trưởng của mỗi loài vi khuẩn là rất quan trọng. Nó cho biết khả năng thích nghi với môi trường cũng như thời gian của các giai đoạn phát triển của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy. Bên cạnh đó, đường cong sinh trưởng còn có thể cho biết thời điểm sinh khối tế bào lớn nhất giúp ta dừng quá trình lên men trong thời gian hợp lý để thu sinh khối tế bào.
Tiến hành xác định đường cong sinh trưởng ở môi trường MRS lỏng, pH = 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 34oC ± 2. Thời gian nuôi cấy được xác định đến 30h, cứ 3h lấy mẫu một lần đo OD600 nm . Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.10.
Bảng 3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD600 nm) theo thời gian nuôi cấy của chủng L1.2 và L1.3
OD600 nm Thời gian (h)
Chủng 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
L1.2 0.34 0.71 1.71 2.13 2.38 2.41 2.43 2.48 2.4 2.26 2.12
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Thời gian (h) O D 6 0 0 n m L1.2 L1.3
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Quan sát các chủng trong quá trình nuôi cấy tĩnh cho thấy chúng sinh trưởng và phát triển tạo nên đường cong sinh trưởng với 4 pha sinh trưởng là pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong.
Ở pha lag (3h đầu của quá trình nuôi cấy), đây là giai đoạn để hai chủng L1.2 và L1.3 thích nghi với môi trường. Tuy nhiên, pha này xảy ra trong khoảng thời gian tương đối ngắn. Điều này được giải thích là do nồng độ tế bào ban đầu của dịch nuôi cấy hai chủng tương đối cao (do được tỷ lệ tiếp giống là 10%) và cả hai chủng được chuyển từ môi trường hoạt hóa giống không khác nhiều so với môi trường lên men nên thời gian dành cho sự thích nghi là không nhiều.
Đến pha log (từ 3h đến 12h nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng vì sau pha lag trong môi trường nuôi đã có số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh đó, đây cũng là thời gian vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong môi trường. Vì vậy, giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa.Kết quả cho thấy sau 6h nuôi, giá trị OD đo được của chủng L1.2 là 1,71 (đạt 68 % so với giá tri OD cực đại), và chủng L1.3 đo được
là 1,75 (đạt 69 % so với giá trị OD cực đại). Ở pha này OD600 tăng liên tục, cứ sau 1h30 phút nuôi cấy thì giá trị OD600 tăng khoảng 12 ÷ 14% (so với giá trị cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 12h nuôi cấy. Ở cuối pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hoàn thiện nhất cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật.
Bước sang giai đoạn cân bằng (từ 12h đến 24h nuôi) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất nên thường chọn thời điểm trong