Sử dụng cho người và động vật
Lactobacillus đã được sử dụng trong chế phẩm probiotic cho con người từ
rất lâu. Vào những năm 1930, Minoru Shirota đã phân lập và bổ sung chủng
Lactobacilus casein vào sản phẩm sữa chua giúp tăng cường tiêu hóa cho người.
Hiện nay, nhiều chủng Lactobacillus như: Lactobacillusacidophillus, Lactobacillus
rhamnosus GG, Lactobacillus kefir… đã được bổ sung vào các sản phẩm sữa,
khác trong thực phẩm có tác dụnggiúp thúc đẩy quá trình tiêu hoá và hấp thu dinh dưỡng cho người.
Lactobacillus cũng đã được sử dụng vào trong chế phẩm probiotic trong y
học phục vụ cho con người. Một số chủng Lactobacillus đã được sử dụng như
Lactobacillus sprorogenes, Lactobacillus kefir, Lactobacillus acidophilus. Nhiều
chế phẩm y học bổ sung các chủng Lactobacillus nêu trên như LGG của công ty Valio (Phần Lan), VIABIOVIT của Công Ty Vắcxin Và Sinh Phẩm Số II…. Trong y học Lactobacillus có tác dụng ức chế các vi khuẩn có hại, kích thích miễn dịch cục bộ và miễn dịch ngoại biên, tăng khả năng tiêu hóa thức ăn. Những nghiên cứu gần đây cho thấy, Lactobacillus còn có tác dụng tốt cho phụ nữ mang thai và trẻ em trước các bênh dị ứng, viêm nhiễm trong đường ruột. Các chế phẩm probiotic còn được sử dụng như một phương thuốc chữa tiêu chảy hiệu quả.
Ngoài ra, Lactobacillus cũng đã được bổ sung vào chế phẩm proiotic trong chăn nuôi gia súc, gia cầm giúp tăng hiệu quả trong chăn nuôi. Nhiều chế phẩm sử dụng Lactobacillus được sản xuất như DYO, BIO-PROBIOTIC dùng trong nuôi lợn thịt, lợn nái và gà đã cho hiệu quả rõ rệt.
Sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
•Những nghiên cứu ở nước ngoài:
Ở một số nước Châu Âu, nhiều chủng Lactobacillus đã được lựa chọn để làm chế phẩm vi sinh trong nuôi cá. Nikoskelainen và cộng sự (2001) đã cho thấy khả năng giảm tỷ lệ chết của cá hồi của hai chủng Lactobacillus rhamnosus và
Lactobacillus bulgaricus với liều lượng bổ sung vào thức ăn của cá là 1012 CFU/g .
Bên cạnh đó, Carnevali và cộng sự (2004) đã cho thấy khả năng cải thiện sức khỏe của cá tráp biển khi bổ sung Lactobacillus plantarum với nồng độ 104 CFU/g (Carnevali và cộng sư, 2004).
Ở Ấn Độ, theo nghiên cứu của Mohanty và cộng sự (1996) cho thấy chế phẩm vi sinh sử dụng Lactobacillus và nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng kích thích sự tăng trưởng của cá chép. Ở Thái Lan, Jiravanichpaisal và cộng sự
(1997) đã sử dụng Lactobacillus trong nuôi tôm sú (P.momodon Fabrius) và giảm được tỷ lệ tôm chết do dịch bệnh gây rabởi nhóm vibrio và bệnh đốm trắng.
Hiện nay đã có rất nhiều chế phẩm probiotic thương mại sử dụng Lactobacillus
như BZT® AQUA, BZT® DIGESTER (Bio-Form, L.L.C., Tulsa, Oklahoma, USA); Aqua Ron (International Biologicals, Ấn Độ); EPICIN-Pond (Epicore BioNetworks Inc - USA )…. Các chế phẩm này có tác dụng làm ổn định chất lượng nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá; nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng tôm cá nuôi; giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên; nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn của thủy sản.
•Những nghiên cứu trong nước:
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi sinh chứa
Lactobacillus spp để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói
riêng còn tương đối ít (Nguyễn Hữu Phúc và Nguyễn Văn Hảo, 1998) Theo Vũ Thị Thứ và cộng sự, (2004) thử nghiệm men vi sinh Biochieđể xử lý nước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi, tăng tỷ lệ sống và tăng trưởng của tôm.
Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh (ES-01 và BS-01 của Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản Sóc Trăng) góp phần đưa năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh. Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM-ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh (http://www.fistenet.gov.vn).
Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2000) tìm hiểu tác dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m3 và cho thấy hiệu quả tích cực trong việc giảm mật độ Vibrio tổng số và ổn định được môi trường nước.
Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Phương (2007) sử dụng 3 loại men vi sinh Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio spp trong môi trường bể ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động từ 59,1 - 76,6%.
Các chế phẩm vi sinh như Biochie ES-01 và BS-01 EM.ZEO Bio-dream Ecomarine, BZT đều chứa hai chủng vi sinh chủ yếu là Bacillus spp và
Lactobacillus spp. Ngoài ra ở nước ta còn nhiều chế phẩm vi sinh khác sử dụng
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus prorogenes, Lactobacillus plantarum như
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng để phân lập Lactobacillus
Các cá thể cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) khỏe mạnh, đã trải qua một số đợt dịch bệnh được lấy từ trại cá Trường Đại học Nha Trang (Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa). Toàn bộ ruột cá được dùng để phân
lập Lactobacillus.
2.1.2. Môi trường dùng trong nghiên cứu
+ Alkaline Peptone Water (APW): Peptone NaCl Nước cất 10 g 10 g 1 lít
Điều chỉnh pH môi trường đạt 8,5 ± 0,2. Hấp ở 1210C trong 10 phút. + MRS:
Casein peptone, tryptic digest - 10 g, cao thịt - 10 g, cao nấm men - 5, glucose -20 g. Tween 80, K2HPO4 - 2 g, Na-acetate – 5 g, (NH4)2 citrate - 2.00 g, MgSO4 . 7 H2O - 0.20 g, MnSO4 . H2O - 0.05 g, nước cất - 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8. Khử trùng 1210C trong 15 phút.
Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,5, sau đó thêm agar vào. Hấp khử trùng ở 121o C trong 15 phút.
+ Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS):
Cao nấm men - 5 g, Peptone - 10g, Sucrose – 20 g, Sodium thiosulfate.75H2O – 10 g, Sodium citrate.72H2O - 10 g, Sodium cholate – 3 g, Oxgall – 5 g, NaCl – 10 g, Ferric citrate – 1 g, Bromothymol blue – 0.04 g, Thymol blue – 0.04 g, Agar -15 g, Nước cất -1 lít.
Cho các chất vào nước cất đã làm ấm và đun nóng để hòa tan. Chỉ để vừa sôi rồi nhấc ra ngay. Không hấp khử trùng. Để nguội đến 50oC rồi đổ đĩa.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu được trình bày trong hình 2.1
Hình 2.1. Sơ đồ tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài
Khả năng chịu mặn
Khả năng sinh axit lactic
Phân lập
Lactobacillus
Mẫu nội tạng cá chim vây vàng
Khả năng di động, phản ứng catalase
Khả năng lên men đường Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio spp Xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa Xác định các đặc tính probiotic và điều kiện nuôi
cấy thích hợp Kết luận Hình thái khuẩn lạc Soi tươi Nhuộm Gram Nhiệt độ pH Thời gian Khả năng sinh enzyme amylase, protease Tốc độ khuấy
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus
Phân lập các chủng Lactobacillus trên nội tạng của cá chim vây vàng trên môi trường MRS.
Cân 5g mẫu nội tạng của cá chim vây vàng cho vào túi nilon, bổ sung 45 ml môi trường tăng sinh để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher trong 1 phút. Sau đó cho vào bình tam giác và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24h đem pha loãng thành các nồng độ 10-2 đến 10-7. Hút 0,1 ml mẫu (Trần Linh Thước, 2008) từ ba nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 cho vào môi trường thạch MRS đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các đĩa petri đã cấy mẫu vào tủ ấm 37oC trong 1 - 2 ngày. Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ các loài thuộc giống Lactobacillus. Chúng được tách ra cấy ria nhiều lần để chọn các dòng thuần chủng, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.3.1.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Lactobacillus
Trong sản suất, nghiên cứu, việc bảo quản và kiểm tra chất lượng của giống là hết sức cần thiết. Vì vậy việc lựa chọn phương pháp giữ giống có vai trò quan trọng trong duy trì được những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hoá giống và không làm mất hoạt tính. Quá trình tiến hành giữ giống:
- Sau khi được phân lập, các chủng Lactobacillus được giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: chọn các đĩa petri có chứa khuẩn lạc thuần chủng, dùng que cấy ria chọn lấy các khuẩn lạc và cấy ria trên môi trường thạch nghiêng MRS đã được chuẩn bị trước. Các ống được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 5oC. Định kỳ 1 tháng cấy truyền giống lại một lần.
- Các chủng Lactobacillus sau khi xác định được các đặc tính probiotic được tiến hành giữ giống trong môi trường MRS lỏng có chứa từ 30 – 50 % glycerol về
thể tích: Các chủng Lactobacillus sau khi đã tuyển chọn được nuôi cấy ở môi trường MRS lỏng, ở 28 -30oC, lắc 180 vòng/phút cho đến khi đạt đến thời gian ở giữa pha Logarit của đường cong sinh trưởng. Hút dịch nuôi cấy cho vào ống eppendoff có chứa glycerol với tỷ lệ từ 30 – 50 % thể tích của ống, lắc các ống đã hút, cho vào tủ lạnh ở 2 - 5oC khoảng 30 phút trước khi đem bảo quản ở tủ đông sâu – 70oC. Phương pháp bảo quản trong glycerol này cho phép chúng ta có thể giữ giống trong thời gian dài từ 6 tháng đến 1 năm.
2.3.1.3. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio
Các chủng Vibrio được sử dụng được lấy từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm và phân lập từ trên đối tượng cá chim vây vàng.
Từ môi trường giữ giống, các chủng Lactobacillus và Vibrio được đưa vào môi trường lỏng tương ứng (Lactobacillus nuôi trên môi trường MRS, Vibrio nuôi trên môi trường APW) và nuôi hoạt hóa qua đêm ở 37oC. Khi mật độ tế bào của Vibrio đạt khoảng 104 CFU ml-1 và mật độ tế bào Lactobacillus đạt khoảng 105 CFU ml-1 thì
Vibrio được trang đều trên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường LB đã chuẩn bị sẵn (Ravi
và cộng sự, 2007). Sau đó đục các lỗ thạch đường kính khoảng 5 mm, hút 50 µl dịch
nuôi cấy các chủng Lactobacillus cho vào các lỗ khoan (Sarker và cs, 2008). Các đĩa đã cấy được nuôi trong tủ ấm 37oC, sau 1 – 2 ngày quan sát các vòng kháng khuẩn và xác định đường kính của nó.
Để chọn lựa được các chủng Lactobacillus kháng lại Vibrio có độ tin cây cao thì chúng ta tiến hành qua 2 – 3 vòng thử đối kháng. Vòng 1 tiến hành thử đối kháng tất cả các chủng Lactobacillus với 2 - 3 chủng Vibrio để tuyển chọn sơ bộ được các chủng có khả năng kháng. Tiếp theo sử dụng các chủng đã tuyển chọn lần 1 để thử khả năng đối kháng với 3 - 4 chủng Vibrio, từ đó chọn ra các chủng có hoạt tính kháng mạnh để làm các bước tiếp theo.
2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái
Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi
Các chủng Lactobacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc với tốc độ 180vòng/phút, ở nhiệt độ 28 ÷ 30oC. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
- Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm trong cồn 950. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật lên phiến kính. Đặt lá kính lên giọt nước (cẩn thận để không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 450 và từ từ hạ xuống).
- Soi kính hiển vi
Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống (sử dụng vật kính 10X và 40X): đặt tiêu bản lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, chọn vật kính 10X, dùng nút chỉnh thô nâng bàn mẫu sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính. Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường. Dùng bộ phận di chuyển bàn mẫu sao cho vùng muốn quan sát nằm giữa thị trường. Chuyển sang vật kính 40X, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh.
Nhuộm Gram
Vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài, dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn Lactic còn có hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi.
Tiến hành:
• Bước 1: Cho một giọt canh trường chứa vi khuẩn lên phiến kính sạch, dàn đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn (tránh không cho ngọn lửa trực tiếp trên vết mẫu).
• Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
• Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
• Bước 4: Dùng cồn 950 tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu (khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất.
• Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu.
Sử dụng vật kính 100X, đặt tiêu bản đã nhuộm Gram lên bàn mẫu và nhỏ một giọt dầu lên vết nhuộm. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn vào mẫu (từ ngoài) và hạ từ từ vật kính 100X sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu. Nhìn vào thị kính, dùng nút chỉnh thô điều chỉnh đến khi thoáng nhìn thấy ảnh thì dừng lại. Sau đó, dùng nút chỉnh tinh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét.
2.3.2.2. Xác định đặc tính sinh hóa Khả năng sinh acid lactic Khả năng sinh acid lactic
• Phương pháp định tính: có 2 phương pháp
- Nuôi vi khuẩn trong hộp petri trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 với lượng 10 g/l. Khi khuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh axit lactic thì xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải. Ngược lại là chủng không sinh axit lactic.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml phenol, thêm từ từ từng giọt FeCl3 1% cho đến khi dung dịch có màu tím của phức phenol-sắt. Sau đó, cho vào dịch nghiên cứu. Nếu màu tím chuyển thành màu vàng thì trong dịch nuôi có mặt axit lactic.
Khả năng sinh catalase
- Mục đích: Xác định khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn
- Cơ sở sinh hóa: Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang tính độc đối với vi sinh vật, không có gì ngạc nhiên là vi sinh vật cũng có thể tự “giải độc” bằng cách tạo ra enzyme có khả năng xúc tác phản ứng phân hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại enzyme này là catalase. Men catalase