1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic 1.3.1.1. Giới thiệu chung
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, …), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất axit lactic và các loại muối của axit lactic. Ngay từ năm 1780 nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau (1878) Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đăt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã hình thành từ năm 1881.
Những vi khuẩn gây lên men lactic được gọi là vi khuẩn lactic, chúng có thể lên men được các loại đường monosacarit, disacarit nhưng không lên men được tinh bột.
Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que, đường kính của các dạng lactic thường từ 0.5 – 1.5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic khoảng 1 – 8 µm, trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Tất cả các vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, Gram+, kỵ khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic lên men được monosaccarit và disaccarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disaccarit nào, một số không lên men được saccarose, một số không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác.
Khả năng tạo thành axit lactic của các loài vi khuẩn lactic khác nhau thi rất khác nhau và như vậy độ bền với axit này cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo được axit lactic cao, các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH
= 3,8 – 4 còn cầu khuẩn không thể phát triển trên môi trường này, hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở pH = 5 – 6.
Đa số vi khuẩn lactic đặc biệt là trực khuẩn lactic đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ các axit amin hoặc các hợp chất Nitơ phức tạp hơn. Ngoài ra chúng còn có nhu cầu về vitamin (B1, B6 , PP, các axit pantotenic, axit folic …). Vì vậy môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic khá phức tạp. Chính các đặc điểm dinh dưỡng về axit amin và vitamin cho nên nhiều chủng vi khuẩn lactic được dùng trong phân tích hai dạng hợp chất này ở các cơ chất khác nhau.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, axit amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Vi khuẩn lactic chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10 % NaCl.
Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 35oC, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 45oC, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối thấp ( <= 5oC). Khi gia nhiệt đến 60 – 80oC thì hầu hết bị chết sau 10 – 30 phút.
Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Như vậy ngoài khả năng tạo ra axit lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (Bacterioxin).
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp trong không khí, đất, nước nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm thực phẩm (rau quả, sữa, thịt,…) một số tìm thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật.
1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic
Người ta dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình.
• Lên men đồng hình
- Lactobacterium casei: đây là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự
nhiên. Yếm khí tuỳ tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 ÷ 1% axit lactic. Ở điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10 đến 12 giờ. Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 10oC, tối ưu là 35oC và tối đa là 45oC, chúng thuỷ phân cazein và gelatin rất yếu.
- Streptococcus cremoris: Thường tạo thành chuỗi dài, thường phát triển ở
nhiệt độ thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 25 ÷ 30oC, lên men glucose, galactose.
- Lactobacterium bulgaricus: đây là trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển tối
ưu là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose. Có khả năng tạo độ axit cao (3,7% axit lactic).
- Lactobacterium delbruckii:thường gặp trên hạt đại mạch, đây là trực khuẩn
lớn. Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng tạo thành sợi. Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 50oC, khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng không được dùng trong chế biến sữa.
- Lactobacterium cueumeris fermenti: thường tìm thấy chúng trong sữa ủ
chua. Là trực khuẩn không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi. Thường chúng tạo thành chuỗi trong quá trình lên men. Khả năng tạo axit tối đa trong môi trường từ 0,9 ÷ 1,2%.
• Lên men dị hình
- Streptobacterium hassice fermentatae: thường thấy chúng trong các dịch
lên men chua rau cải. Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt hoặc ghép thành từng đôi, hoặc chuỗi ngắn có khi ghép thành từng chuỗi dài hình sợi. Khi lên men rau cải chua tạo thành axit lactic, axit axetic, rượu etylic và CO2. Lên men đường saccarose tốt hơn lên men đường lactose.
- Lactobacterium lycopersici: là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo
lactic, rượu êtylic, axit axetic và CO2. Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 80oC.
1.3.1.3. Dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ… Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
•Nhu cầu Cacbon
Cacbon là thành tố chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi loài sinh vật. Vì vậy sự chuyển hoá nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật, chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose (glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
+ Glucose ở dạng D- glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng nhất. Chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hoá hơn. Vì vậy trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này cho vi sinh vật dễ sử dụng.
+ Lactose là disaccarit, nó là đường có trong sữa người và động vật. Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vì chúng có khả năng sinh enzym β-galactosidase. Enzym này thuỷ phân lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn được dễ dàng hơn.
+ Sucrose cũng là một disaccarit. Trong quá trình lên men dưới tác dụng của enzym sucrose hydrolase, sucrose bị thuỷ phân thành glucose và fructose. Ở vài loài lactococci, sucrose được vận chuyển bởi hệ enzym sucrose phosphotransferase và một enzym đặc hiệu sucrose-6-phosphate hydrolase phân cắt sucrose-6-phosphate
thành glucose-6-phosphate và fructose. Những enzym này chỉ được tiết ra khi xuất hiện sucrose trong môi trường (Thompson và Chassy, 1981).
+ Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thuỷ phân tinh bột thành đường, có 3-20 chuỗi. Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextroza liên kết với nhau bởi liên kết hidro yếu.
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccrit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột (William và Wilkins, 1986). Sự phát triển của vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các quá trình xử lý sau này. Nhóm các nhà khoa học của Carvalho đã khẳng định rằng khả năng sống sót của L. bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỷ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose (Carvalho và cộng sự, 2004). Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào.
•Nhu cầu nitơ
Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả sinh vật. Vật chất cơ bản của tế bào (protein, axit nucleic…) đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều axit amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn
nguồn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình. Axit amin có thể được đồng hoá dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzym protease ngoại bào hay nội bào.
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ
như L. helveticus, chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong
môi trường (Chopin, 1993).
Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao được hiệu quả sản xuất. Trong đó dịch nấm men thuỷ phân được sử dụng khá nhiều (Lars Axelsson, 2004).
•Nhu cầu chất khoáng và vitamin
Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnh
hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối với
Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic,
hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzym protease thuỷ phân một số protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào. Nhìn chung mangan và magie là những chất đóng các vai trò chủ yếu sau:
+ Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzym. + Giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy.
+ Ổn định cấu trúc tế bào.
Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi khuẩn lactic sử dụng tốt hơn các loại đường. Carvalho và cộng sự đã nhận thấy là khi bổ sung NaCl và saccarose vào môi trường MRS khi nuôi cấy L. bulgaricus đem lại
những kết quả khác nhau trong quá trình tạo sinh khối và tỷ lệ sống sót của tế bào trong khi sấy và bảo quản sau này (Carvalho và cộng sự, 2004).
Các chất chứa axit béo có mặt trong môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chúng không những kích thích sinh trưởng mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông sau này. Ví dụ Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thay đổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mặn của vi khuẩn lactic (Ho Phu Ha và Michelle Cartherine Adams, 2007).
1.3.1.4. Nuôi cấy vi khuẩn lactic
•Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn. Tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp. Tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn làm thức ăn nhanh chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men. Thông thường trong quá trình sản xuất, tỷ lệ tiếp giống của vi khuẩn khoảng 5 ÷ 10% và của nấm men khoảng 8 ÷ 10%.
•Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh axit làm pH môi trường giảm, khi pH môi trường giảm đến một mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy trong quá trình nuôi người ta phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn phát triển. Mỗi một loài vi khuẩn lactic có một khoảng pH tối thích khác nhau, dao động trong khoảng 4,5 - 6,5, nhưng cũng có một số chủng có thể phát triển ở pH=9,6 và một số hoạt động ở pH=3,2 như
Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH=3. Theo Giraud và cộng sự đối với vi
khuẩn L. plantarum A6, sự giảm pH sẽ làm giảm sự chuyển hoá cơ chất. Ngoài ra Silva và cộng sự đã tìm ra mối liên hệ giữa pH cuối cùng của môi trường nuôi cấy
chủng L. bulgaricus liên quan đến quá trình sấy phun và bảo quản khô sau này. Họ nhận định được tế bào sẽ chịu được quá trình xử lý nhiệt độ tốt hơn nếu trong quá trình nuôi cấy không điều chỉnh pH (Lars Axelsson, 2004).
•Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ ảnh hưởng đến các phản ứng enzym của tế bài vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Ví dụ: vi khuẩn Lactobacillus fermentum là loài ưa ấm, phát triển tốt ở nhiệt độ cơ thể người 37oC.
•Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan
Vi khuẩn lactic thuộc loài yếm khí tùy tiện nên không đòi hỏi về oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy. Mặt khác, quá trình lên men lactic chủ yếu thực hiện trong môi trường yếm khí để tạo ra axit lactic, có nghĩa là oxy tham gia rất ít vào quá trình này. Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy cũng phải cần một lượng nhỏ oxy ban đầu để vi khuẩn lactic sinh trưởng phát triển, tạo sinh khối.