CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xác định các đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic của chủng L1.2 và L1.3
3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Việc xác định đường cong sinh trưởng của mỗi loài vi khuẩn là rất quan trọng. Nó cho biết khả năng thích nghi với môi trường cũng như thời gian của các giai đoạn phát triển của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy. Bên cạnh đó, đường cong sinh trưởng còn có thể cho biết thời điểm sinh khối tế bào lớn nhất giúp ta dừng quá trình lên men trong thời gian hợp lý để thu sinh khối tế bào.
Tiến hành xác định đường cong sinh trưởng ở môi trường MRS lỏng, pH = 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 34oC ± 2. Thời gian nuôi cấy được xác định đến 30h, cứ 3h lấy mẫu một lần đo OD600 nm . Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.10.
Bảng 3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD600 nm) theo thời gian nuôi cấy của chủng L1.2 và L1.3
OD600 nm Thời gian (h)
Chủng 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
L1.2 0.34 0.71 1.71 2.13 2.38 2.41 2.43 2.48 2.4 2.26 2.12
L1.3 0.47 0.93 1.75 2.26 2.32 2.47 2.5 2.53 2.5 2.35 2.09
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Thời gian (h)
OD 600 nm
L1.2 L1.3
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Quan sát các chủng trong quá trình nuôi cấy tĩnh cho thấy chúng sinh trưởng và phát triển tạo nên đường cong sinh trưởng với 4 pha sinh trưởng là pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong.
Ở pha lag (3h đầu của quá trình nuôi cấy), đây là giai đoạn để hai chủng L1.2 và L1.3 thích nghi với môi trường. Tuy nhiên, pha này xảy ra trong khoảng thời gian tương đối ngắn. Điều này được giải thích là do nồng độ tế bào ban đầu của dịch nuôi cấy hai chủng tương đối cao (do được tỷ lệ tiếp giống là 10%) và cả hai chủng được chuyển từ môi trường hoạt hóa giống không khác nhiều so với môi trường lên men nên thời gian dành cho sự thích nghi là không nhiều.
Đến pha log (từ 3h đến 12h nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng vì sau pha lag trong môi trường nuôi đã có số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh đó, đây cũng là thời gian vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong môi trường. Vì vậy, giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa.Kết quả cho thấy sau 6h nuôi, giá trị OD đo được của chủng L1.2 là 1,71 (đạt 68 % so với giá tri OD cực đại), và chủng L1.3 đo được
là 1,75 (đạt 69 % so với giá trị OD cực đại). Ở pha này OD600 tăng liên tục, cứ sau 1h30 phút nuôi cấy thì giá trị OD600 tăng khoảng 12 ÷ 14% (so với giá trị cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 12h nuôi cấy. Ở cuối pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hoàn thiện nhất cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật.
Bước sang giai đoạn cân bằng (từ 12h đến 24h nuôi) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất nên thường chọn thời điểm trong giai đoạn cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật. Kết quả OD600 nm đo được cũng thể hiện rừ giỏ trị OD600 nm ở pha cõn bằng lớn hơn so với ở cỏc pha khỏc và sau 21h nuôi cả 2 chủng L1.2 và L1.3 có nồng độ tế bào cao nhất. Tiếp tục nuôi cấy, sau 24h thì nồng độ tế bào cả hai chủng bắt đầu giảm xuống. Đến khoảng 30h nuôi thì mật độ tế bào của 2 chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào của chủng L1.2 chỉ còn đạt được 82% và đối với chủng L1.3 chỉ còn 85% (so với giá trị cực đại). Điều này cho thấy vi sinh vật đã đến giai đoạn suy vong do chất dinh dưỡng trong môi trường giảm xuống, các chất ức chế do vi sinh vật sản sinh ra như axit lactic, bacterioxin đã gây ức chể trở lại cho vi sinh vật…dẫn đến vi sinh vật không tổng hợp được các thành phần tế bào, các quá trình trao đổi chất bị đình trệ và vi sinh vật tử vong. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn này.
Như vậy qua thí nghiệm này đã tìm được thời điểm cuối pha sinh trưởng (12h nuôi) để lấy mẫu tiến hành giữ giống và thực hiện các phản ứng sinh hóa bởi vì ở thời điểm này quần thể tế bào của cả 2 chủng L1.2 và L1.3 có các đặc tính sinh lý, sinh hóa đồng đều như nhau.
Qua thí nghiệm này cũng đã tìm được thời gian phát triển tốt nhất của 2 chủng L1.2 và L1.3 là 21h giờ. Với mục đích thu nhận sinh khối lớn nhất trong quá trình lên men của 2 chủng L1.2 và L1.3 để sản xuất chế phẩm probiotic nên thời gian lên men được lựa chọn là 21h.