Với mục đích ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotic cho nuôi trồng thuỷ sản. Do vậy, ta cần xác định khả năng chịu mặn của các chủng L1.2 và L1.3. Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS, pH 6.8 ± 0.2, nhiệt độ 34oC, tốc độ lắc 180 vòng/phút, ở các độ mặn khác nhau là 0%, 1%, 2%, 3%, 4% và 5% . Xác định nồng độ tế bào bằng phương pháp đo OD600 nm sau 21h nuôi . Kết quả được trình bày trên bảng 3.6 và hình 3.14.
Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng (OD600 nm) ở các nồng độ muối khác nhau của chủng L1.2 và L1.3 OD600 nm Nồng độ muối (%) Chủng 0 1 2 3 4 L1.2 2.53 2.5 2.47 2.46 2.36 L1.3 2.3 1.42 1.23 1.16 1.07
0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 1 2 3 4 5 Nồng độ muối NaCl (%) O D 6 00 n m L1.2 L1.3
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Kết quả cho thấy sự phát triển của 2 chủng tỷ lệ nghịch với độ mặn của môi trường. Chủng L1.2 có khả năng phát triển ở nồng độ muối NaCl đến 5%. Ở nồng độ này nồng độ tế bào đo được còn đến 88% so với trường hợp không bổ sung muối vào môi trường. Chủng L1.3 có khả năng chịu mặn yếu hơn chủng L1.2, nồng độ tế bào giảm dần ở các nồng độ muối cao hơn và đến 5% muối thì sự phát triển của chủng L1.3 rất yếu, nồng độ tế bào chỉ còn khoảng 40% so với nuôi trong điều kiện không bổ sung muối.
Hai chủng L1.2 và L1.3 có khả năng chịu mặn tương đối tốt bởi vì chúng được phân lập từ cá chim vây vàng sống trong môi trường biển (độ mặn trung bình của nước biển là khoảng 3%). Đặc biệt, khả năng chịu mặn của chủng L1.2 tương đối cao, chủng L1.2 có thể tồn tại và phát triển tốt ở nồng độ muối NaCl lên đến 5%. Khả năng chịu mặn cao của chủng L1.2 và L1.3 sẽ giúp cho các chủng có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường nước biển. Đây là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm probiotic cho NTTS ở các vùng biển khác nhau.
3.3.6. Khả năng sinh enzyme amylase và protease của hai chủng L1.2 và L1.3
Hai chủng L1.2 và L1.3 nuôi cấy trên môi trường MRS sau 21h, dịch nuôi cấy được đem ly tâm 8000 vòng/phút trong thời gian 15 phút và lấy dịch ly tâm cho vào các lỗ đã được đục sẵn trên môi trường cơ bản chứa các cơ chất tương ứng. Hoạt tính enzyme protease và amylase được xác định lần lượt trên môi trường cơ bản chứa lần lượt cơ chất là casein 1% và tinh bột 1%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng L1.2 và L1.3
Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 chủng L1.2 và L1.3 có hoạt tính enzyme rất thấp, không có hoạt tính enzyme amylase. Như vậy, nếu sử dụng 2 chủng L1.2 và L1.3 vào chế phẩm proiotic thì cần bổ sung các enzyme thô hoặc các vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh như nhóm Bacillus...để giúp tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ trong thức ăn, giúp tăng khả năng tiêu hóa thức ăn, tăng khả năng sinh trưởng cho cá. Bên cạnh đó, các enzyme này còn phân giải các chất hữu cơ dư thừa trong môi trường, giúp làm sạch môi trường nước nuôi.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ các mẫu cá chim vây vàng được lấy từ Trại cá Trường đại học Nha Trang (tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa) phân lập được 5 chủng
Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio mạnh, trong đó hai chủng L1.2
và L1.3 có hoạt tính kháng Vibrio mạnh nhất, chúng có kháng cả ba loài
V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. chorela. Hoạt tính kháng Vibrio
mạnh nhất thể hiện ở sau 24 giờ nuôi cấy.
2. Hai chủng L1.2 và L1.3 có các đặc điểm sinh học của chi vi khuẩn
Lactobacillus bao gồm: là trực khuẩn G+, không tạo bào tử, không di
động, có khả năng sử dụng các loại đường (glucose, sucrose, mantose, manitol, sorbitol, lactose) và có khả năng sinh axit lactic.
3. Cả hai chủng L1.2 và L1.3 đều phát triển tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 34oC, pH khoảng 6 ÷ 7, tốc độ lắc 180 vòng/phút và thời gian nuôi cấy thích hợp là 21h nuôi. Hai chủng có khả năng chịu mặn đến 5% muối NaCl và khả năng sinh enzyme amylase, protease rất thấp.
Kiến nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu sử dụng hai chủng L1.2 và L1.3 vào chế phẩm probiotic để nuôi thử nghiệm trên cá chim vây vàng.
2. Cần có những nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng Vibrio của các chủng
Lactobacillus.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ thủy sản, Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản, dự án cải
thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản, NXB nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội,
296 tr, 2004.
2. Bùi Trọng Khiêm, Tìm hiểu kỹ thuật ương giống cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) tại Trại Thực nghiệm sản xuất Hải sản
- Vĩnh Hòa - Nha Trang, 41 tr, 2008
3. Nguyễn Văn Sơn, Kỹ thuật nhân tạo sản xuất giống cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) tại trại thực nghiệm Trường Cao Đẳng
Thủy Sản – Yên Hưng – Quảng Ninh, tr 6 – 9, 2008.
4. Trần Duy Thiết, Nghiên cứu ứng dụng chủng Lactobacillus acidopillus trong sản xuất chế phẩm sinh học (BIOF) dùng trong phòng và trị bệnh cho tôm cá, 54 tr, 2004.
5. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, Bệnh
học thủy sản, NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 224
– 231, 2004.
6. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi Khánh Hòa,
Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản ( số 02/2008) – Đại học Nha
Trang, tr. 16 – 24, 2008.
7. Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên, Bệnh tử hoại thần kinh trên cá biển nuôi tại
Khánh Hòa, Tạp chí Khoa học –Công nghệ Thủy Sản (số 01/2008) – Đại học
Nha Trang, tr 19 – 24, 2008.
8. Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội, 358 tr, 1998.
9. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm
Tiếng Anh
1. Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL, Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment
and cell invasion by enterovirulent bacteria, Gut 35, pp 483-489, 1994.
2. Briggs, M. R. P. & Funge-Smith, S. J, A nutrient budget of some intensive
marine shrimp ponds in Thailand, Aquaculture and Fisheries Management.
(25), pp 789-811, 1994.
3. Carvalho, A.S. Silva. J, Ho. P. Teixeia, F. X. Gibbs, Relevant factor for the
preparation of freeze-died lactic acid bacteria, International Dairy Journal,
(14), pp 835-847, Elsrier Science B.V, 2004.
4. De Man. J.C., Rogosa, M and Sharpe, M.E, A medium for the cultivation of
Lactobacilli, Journal of applied bacteriology (23), pp 130-135, 1960.
5. Direkbusarakom, S., Yoshimizu, M., Ezura, Y., Ruangpan, L., Danayadol Y.,
Vibrio spp. the dominant flora in shrimp hatchery against some fish
pathogenic viruses, J. Mar. Biotechnol ( 6), pp 266–267, 1998.
6. Ho Phu Ha and Michelle Cartherine Adams, Selection and identifinication of a novel probiotic strans of Lactobacillus fermentum isolated from Vietnamese fermented food, School of Enviromental and Life Science,
Faculty of Science and Information Technology, The University of
Newcastle, Australia, 2007.
7. Hollang, K. T., J. S. Knapp, and J. G. Shoesmith, Anaerobic Bacteria” 1st ed. Blackie and Son, Ltd., London, 1987.
8. Kamei, Y., Yoshimizu, M., Ezura Y., Kimura, T., Screening of bacteria with
antiviral activity from fresh water salmonid hatcheries, Microbiol Immunol.
(32), pp 67–73, 1988.
9. Kenneth H. Wilson and Fulvio Perin2, Role of Competition for Nutrients in
Suppression of Clostridium dijficile by the Colonic Microflora, INFECTION
10. LARS AXELSSON, Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology”. MATFORSK, Norwegian Food Research Institute, As, Norway, 2004.
11. Mack DR, Michail S, Wei S, Wei S, Macdougal L, Hollingsworth MA,
Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing
intestinal mucin gene expression, Am J Physiol (39), pp 941-950, 1999.
12. Mishra, C. and J. Lambert, Production of anti-microbial substances by
probiotics, Asia Pacific J Clin Nutr (5), pp 20–24, 1996.
13. Nikoskelainen S, Ouwehand AC, Salminen S, Bylund G, Protection of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) from furunculosis by Lactobacillus
rhamnosus, Aquaculture 2001b (198), pp 229-236, 2001.
14. O’Sullivan, D. J. and M. J. Kullen., Tracking of probiotic bifidobacteria in
the intestine, Intl Dairy J (8), pp 513–525, 1998.
15. Patricia Neysens, Winy Messens, Luc De Vuyst, Effect of sodium chloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE
471, International Journal of Food Microbiology (88), pp 29– 39, 2003.
16. Porter, C. B., Krom, M. D., Robbins, M. G., Brickel, L. & Davidson, A,
Ammonia excretion and total N budget for Gilthead Seabream (Sparus
aurata) and its effect of water quality conditions, Aquaculture (66), pp 287-
297, 1987.
17. Prieur, G., Nicolas, J.L., Plusquellec, A., Vigneulle M., Interactions between
bivalves molluscs and bacteria in the marine environment, Oceanogr. Mar.
Biol. Annu. Rev (28), pp 227–352, 1990.
18. Sakata, T., Microflora in the digestive tract of fish and shellfish,
Microbiology in Poecilotherms, Elsevier, Amsterdam, pp 171–176, 1990.
19. Saurabh S, Choudhary AK and Sushma GS, Concept of probiotics in
aquaculture, Fishing Chimes( 25), pp 19–22, 2005.
20. Srikanjana Klayraung, Helmut Viernstein, Jakkapan Sirithunyslug, Siriporn Okonogi, Probiotic Properties of Lactobacilli Isolated from Thai
21. Tanaka S, I Kuriyama, T Nakai and Miyazaki, Susceptibility of cultured juveniles of several marine fish to the sevenband grouper nervous necrosis
virus, Journal of fish diseases (26), pp 109-115, 2003.
22. Teruo Higa, Technology of Effective Microorganisms, Concept and
Phisiology. Royal Agricultural College, Cirencester, UK, 2002.
23. Thompson, J.; Chassy, B.M., Uptake and metabolism of sucrose by
Streptococcus lactis, J. Bacteriol (147), pp 543–551, 1981.
24. Wu, R., The environmental impact of marine fish culture: toward a
sustainable future, Mar Pollut Bull (31), pp 159-166, 1995.
25. W. Charenrnjiratragul, P. Bhoopong, D. Kantachote, S. Iomduang, R. Kong – Ngoen, G.B. Nair and V.Vuddhakul, Inhibitory activity of lactic acid bacteria isolated from Thai fermented food against pandemic strains of
PHẦN PHỤ LỤC
Hình P1. Hình ảnh cấy ria chủng L1.2 trên môi trường MRS
Hình P3. Khả năng kháng Vibrio C1 của một số chủng Lactobacillus