CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa
Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi - Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn.
Các chủng Lactobacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc với tốc độ 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 ÷ 30oC. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
- Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm trong cồn 950. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống:
nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật lên phiến kính. Đặt lá kính lên giọt nước (cẩn thận để không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 450 và từ từ hạ xuống).
- Soi kính hiển vi
Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống (sử dụng vật kính 10X và 40X): đặt tiêu bản lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, chọn vật kính 10X, dùng nút chỉnh thô nâng bàn mẫu sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính.
Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường.
Dùng bộ phận di chuyển bàn mẫu sao cho vùng muốn quan sát nằm giữa thị trường.
Chuyển sang vật kính 40X, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh.
Nhuộm Gram
Vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài, dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn Lactic còn có hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi.
Tiến hành:
• Bước 1: Cho một giọt canh trường chứa vi khuẩn lên phiến kính sạch, dàn đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn (tránh không cho ngọn lửa trực tiếp trên vết mẫu).
• Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
• Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
• Bước 4: Dùng cồn 950 tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu (khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất.
• Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu.
Sử dụng vật kính 100X, đặt tiêu bản đã nhuộm Gram lên bàn mẫu và nhỏ một giọt dầu lên vết nhuộm. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn vào mẫu (từ ngoài) và hạ từ từ vật kính 100X sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu. Nhìn vào thị kính, dùng nút chỉnh thô điều chỉnh đến khi thoáng nhìn thấy ảnh thì dừng lại. Sau đú, dựng nỳt chỉnh tinh cho đến khi nhỡn thấy ảnh rừ nột.
2.3.2.2. Xác định đặc tính sinh hóa Khả năng sinh acid lactic
• Phương pháp định tính: có 2 phương pháp
- Nuôi vi khuẩn trong hộp petri trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 với lượng 10 g/l. Khi khuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh axit lactic thì xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải. Ngược lại là chủng không sinh axit lactic.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml phenol, thêm từ từ từng giọt FeCl3 1% cho đến khi dung dịch có màu tím của phức phenol-sắt. Sau đó, cho vào dịch nghiên cứu. Nếu màu tím chuyển thành màu vàng thì trong dịch nuôi có mặt axit lactic.
Khả năng sinh catalase
- Mục đích: Xác định khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn
- Cơ sở sinh hóa: Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang tính độc đối với vi sinh vật, không có gì ngạc nhiên là vi sinh vật cũng có thể tự “giải độc” bằng cách tạo ra enzyme có khả năng xúc tác phản ứng phân hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại enzyme này là catalase. Men catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa cytochrome.
- Phương pháp thử: thử trên lam kính: Dùng que cấy lấy tâm khuẩn lạc thuần đã nuôi trên môi trường MRS đặc đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30%
lên khuẩn lạc nằm trên lam kính. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalase trong tế bào.
- Lưu ý:
+ Khi thử nghiệm trên lam không được đảo trộn trình tự tiến hành (không đưa H2O2 lên lam kính trước vi sinh vật) bởi cả sắt lẫn platinum có trong que cấy đều có thể gây phản ứng dương tính giả.
+ Nên dùng các khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian 18 – 24 giờ vì những khuẩn lạc già hơn có thể gây mất hoạt tính catalase và gây phản ứng âm tính giả.
+ H2O2 30% rất không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung dịch và cần kiểm tra hoạt tính trước khi dùng.
Khả năng di động
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường thạch MRS, cao 5 ÷ 6cm. Chủng Lactobacillus được cấy đâm sâu trong môi trường thạch đứng: dùng que cấy đầu nhọn chấm vào dịch nuôi rồi đâm sâu thẳng xuống ống thạch đứng chứa môi trường thạch MRS. Các ống nghiệm được nuôi ở nhiệt độ 30 ÷ 35oC. Tiến hành quan sát sau 2 ngày nuôi cấy.
Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chủng có khả năng di động.
Vi khuẩn chỉ mọc dọc theo vết cấy chứng tỏ chủng không có khả năng di động và hô hấp tuỳ tiện.
Vi khuẩn mọc trên bề mặt ống thạch chứng tỏ chủng hô hấp hiếu khí.
Khả năng sử dụng các loại đường
Sử dụng môi trường cơ bản gồm có: Cao thịt- 3 g; Pepton- 10 g; NaCl- 5 g;
phenol đỏ – 0,03g; thêm nước cất đến 1000 ml. Bổ sung các loại đường khác nhau (glucose, lactose, maltose, manitol, sorbitol, sucrose) với nồng độ 0,5% và chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 10 phút ở 121oC.
Cấy vi khuẩn mới hoạt hoỏ vào cỏc ống nghiệm, đặt ở 37oC, theo dừi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị sẽ chuyển màu vàng lục.
2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy