3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Việc xác định đường cong sinh trưởng của mỗi loài vi khuẩn là rất quan trọng. Nó cho biết khả năng thích nghi với môi trường cũng như thời gian của các giai đoạn phát triển của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy. Bên cạnh đó, đường cong sinh trưởng còn có thể cho biết thời điểm sinh khối tế bào lớn nhất giúp ta dừng quá trình lên men trong thời gian hợp lý để thu sinh khối tế bào.
Tiến hành xác định đường cong sinh trưởng ở môi trường MRS lỏng, pH = 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 34oC ± 2. Thời gian nuôi cấy được xác định đến 30h, cứ 3h lấy mẫu một lần đo OD600 nm . Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.10.
Bảng 3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD600 nm) theo thời gian nuôi cấy của chủng L1.2 và L1.3
OD600 nm Thời gian (h)
Chủng 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
L1.2 0.34 0.71 1.71 2.13 2.38 2.41 2.43 2.48 2.4 2.26 2.12
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Thời gian (h) O D 6 0 0 n m L1.2 L1.3
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Quan sát các chủng trong quá trình nuôi cấy tĩnh cho thấy chúng sinh trưởng và phát triển tạo nên đường cong sinh trưởng với 4 pha sinh trưởng là pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong.
Ở pha lag (3h đầu của quá trình nuôi cấy), đây là giai đoạn để hai chủng L1.2 và L1.3 thích nghi với môi trường. Tuy nhiên, pha này xảy ra trong khoảng thời gian tương đối ngắn. Điều này được giải thích là do nồng độ tế bào ban đầu của dịch nuôi cấy hai chủng tương đối cao (do được tỷ lệ tiếp giống là 10%) và cả hai chủng được chuyển từ môi trường hoạt hóa giống không khác nhiều so với môi trường lên men nên thời gian dành cho sự thích nghi là không nhiều.
Đến pha log (từ 3h đến 12h nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng vì sau pha lag trong môi trường nuôi đã có số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh đó, đây cũng là thời gian vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong môi trường. Vì vậy, giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa.Kết quả cho thấy sau 6h nuôi, giá trị OD đo được của chủng L1.2 là 1,71 (đạt 68 % so với giá tri OD cực đại), và chủng L1.3 đo được
là 1,75 (đạt 69 % so với giá trị OD cực đại). Ở pha này OD600 tăng liên tục, cứ sau 1h30 phút nuôi cấy thì giá trị OD600 tăng khoảng 12 ÷ 14% (so với giá trị cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 12h nuôi cấy. Ở cuối pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hoàn thiện nhất cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật.
Bước sang giai đoạn cân bằng (từ 12h đến 24h nuôi) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất nên thường chọn thời điểm trong giai đoạn cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật. Kết quả OD600 nm đo được cũng thể hiện rõ giá trị OD600 nm ở pha cân bằng lớn hơn so với ở các pha khác và sau 21h nuôi cả 2 chủng L1.2 và L1.3 có nồng độ tế bào cao nhất. Tiếp tục nuôi cấy, sau 24h thì nồng độ tế bào cả hai chủng bắt đầu giảm xuống. Đến khoảng 30h nuôi thì mật độ tế bào của 2 chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào của chủng L1.2 chỉ còn đạt được 82% và đối với chủng L1.3 chỉ còn 85% (so với giá trị cực đại). Điều này cho thấy vi sinh vật đã đến giai đoạn suy vong do chất dinh dưỡng trong môi trường giảm xuống, các chất ức chế do vi sinh vật sản sinh ra như axit lactic, bacterioxin đã gây ức chể trở lại cho vi sinh vật…dẫn đến vi sinh vật không tổng hợp được các thành phần tế bào, các quá trình trao đổi chất bị đình trệ và vi sinh vật tử vong. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn này.
Như vậy qua thí nghiệm này đã tìm được thời điểm cuối pha sinh trưởng (12h nuôi) để lấy mẫu tiến hành giữ giống và thực hiện các phản ứng sinh hóa bởi vì ở thời điểm này quần thể tế bào của cả 2 chủng L1.2 và L1.3 có các đặc tính sinh lý, sinh hóa đồng đều như nhau.
Qua thí nghiệm này cũng đã tìm được thời gian phát triển tốt nhất của 2 chủng L1.2 và L1.3 là 21h giờ. Với mục đích thu nhận sinh khối lớn nhất trong quá trình lên men của 2 chủng L1.2 và L1.3 để sản xuất chế phẩm probiotic nên thời gian lên men được lựa chọn là 21h.
3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng do đó kéo dài thời gian thu sinh khối. Còn nhiệt độ cao sẽ làm ức chế các chủng vi sinh vật. Với mục đích sản suất sinh khối thì việc yêu cầu tìm được khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu của mỗi chủng vi sinh vật là rất quan trọng.
Để tìm khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu của chủng L1.2 và L1.3, tiến hành lên men trong môi trường MRS lỏng ở các nhiệt độ: 30oC; 34oC; 37oC và 40oC ở pH 6,8 ± 0,2. Xác định nồng độ tế bào bằng phương pháp đo OD ở bước sóng λ = 600nm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.11:
Bảng 3.4. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD600 nm) ở các nhiệt độ khác nhau của chủng L1.2 và L1.3 OD600 nm Nhiệt độ (oC) Chủng 30 oC 34oC 37oC 40oC L1.2 2,51 2,52 2,52 2,45 L1.3 2,48 2,53 2,49 2,36
2.3 2.35 2.4 2.45 2.5 2.55 30 32 34 36 38 40 Nhiệt độ O D 6 0 0 n m L1.2 L1.3
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Kết quả nghiên cứu cho thấy cả hai chủng L1.2 và L1.3 là các vi khuẩn ưa ấm, có nhiệt độ phát triển tối ưu là 34oC. Nhiệt độ này có thể giải thích được do nguồn gốc của hai chủng. Bởi vì cả hai chủng được phân lập từ cá chim vây vàng nuôi ở biển Khánh Hòa. Cá chim vây vàng là loài cá sống ở tầng mặt và nhiệt độ trung bình của nước biển trong khoảng 28 - 34oC nên nhiệt độ nuôi cấy tối ưu của hai chủng là 34oC là rất phù hợp với thực tế.
Kết quả nghiên cứu cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Tatsuro Hagy và Takayuki Hoshino (2009). Các chủng vi khuẩn lactic được họ phân lập trên cá chép có cũng nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 – 33oC.
Như vậy, qua thí nghiệm này đã tìm được nhiệt độ phát triển tối ưu của hai chủng L1.2, L1.3 là 34oC, rất gần với nhiệt độ tự nhiên của nước biển. Điều này rất quan trọng vì nó sẽ giúp cho các chủng trên có khả năng tồn tại và phát triển tốt khi được đưa vào trong môi trường nước biển trong các chế phẩm probiotic sau này.
3.3.3. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 trong môi trường MRS lỏng. Chủng L1.2 và L1.3 được nuôi cấy trong môi trường có các giá trị pH là 4, 5, 6, 7, 8 ở nhiệt độ 34oC, trong thời gian 21h. Xác định khả năng phát triển bằng phương pháp đo OD600 nm. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên bảng 3.5 và hình 3.12.
Bảng 3.5. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD600 nm) ở các giá trị pH môi trường khác nhau của chủng L1.2 và L1.3
OD600 nm pH Chủng 4 5 6 7 L1.2 2,04 2,19 2,28 2.31 L1.3 2,12 2,21 2,32 2,33 2 2.1 2.2 2.3 2.4 4 5 6 7 8 pH O D 6 0 0 n m L1.2 L1.3
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Kết quả nghiên cứu cho thấy pH ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của cả 2 chủng L1.2 và L1.3. Cả 2 hai chủng L1.2 và L1.3 đều phát triển tốt ở môi trường có pH 6 ÷ 7. Ở môi trường có pH 8, các chủng bắt đầu có dấu hiệu phát triển kém hơn. Khoảng pH từ 5 ÷ 6 các chủng vẫn phát triển được nhưng ở pH từ 4 ÷ 5 cả 2 chủng đã bị ức chế.
Kết quả thí nghiệm cho thấy hai chủng phát triển tốt ở pH trung tính và hơi kiềm (pH 6 ÷ 7), phù hợp với đặc tính chung của nhóm vi khuẩn này, mức pH 8 và pH 4 đều hạn chế khả năng sinh trưởng nên có thể xem như là giới hạn trên và giới hạn dưới cho khả năng chịu đựng pH của chủng L1.2 và L1.3.
Với pH ổn định của nước biển trong khoảng 7,5 ÷ 8,4 thì hai chủng rất thích hợp cho việc bổ sung vào chế phẩm probitic trong NTTS, đặc biệt là các loài cá nuôi biển. Đây là một đặc điểm quan trọng bởi nó sẽ giúp cho các chủng có khả năng tồn tại và phát triển tốt trong môi trường nước biển khi được đưa vào chế phẩm probiotic phục vụ cho nuôi trồng thủy sản sau này.
Tuy nhiên, do 2 chủng này phát triển kém ở khoảng pH 4 ÷ 5 nên khả năng tồn tại của chúng trong đường ruột cá khi bổ sung chế phẩm vào thức ăn cho cá là rất thấp. Khi các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic đi qua dạ dày thì một phần lớn vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt bởi môi trường axit rất thấp (pH khoảng 2 đến 4) của dạ dày cá, các vi sinh vật còn lại sẽ được đi xuống ruột non, ruột già có pH khoảng 6,5 ÷ 7 để phát triển. Vì vậy, chế phẩm probiotic chứa các chủng vi sinh vật này phải đảm bảo vi sinh vật không được giải phóng tại dạ dày mà chúng chỉ được giải phóng tại ruột non. Hướng giải quyết được đề xuất cho vấn đề này là nên tạo màng gel bao bọc (canxi-alginate, carageenan…) hay đưa chủng vi sinh vào trong các giọt dầu, giọt nhũ tương. Tuy nhiên, để áp dụng được các phương pháp này cần có các nghiên cứu thêm.
Qua thí nghiệm này đã tìm được khoảng pH thích hợp cho môi trường nuôi cấy hai chủng L1.2 và L1.3 là pH 6 ÷ 7. Sử dụng kết quả này cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến khả năng phát triển của L1.2 và L1.3
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 trong môi trường MRS lỏng. Tốc độ khuấy trộn được khảo sát ở các mức tốc độ lắc 0, 100, 140, 180, 220 vòng/phút, ở nhiệt độ 34oC, trong thời gian 21h. Xác định nồng độ tế bào bằng phương pháp đo OD600 nm. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.13.
2.3 2.4 2.5 2.6 OD 600 nm 0 100 140 180 220 Tốc độ lắc (vòng/phút) L1.2 L1.3
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn lênsự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ khuấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cá 2 chủng L1.2 và L1.3. Cả 2 chủng đều phát triển tốt nhất ở tốc độ khuấy 180 vòng/phút. Ở tốc độ khuấy dưới 180 vòng/phút thì 2 chủng phát triển chậm hơn và ở 220 vòng/phút thì sự phát triển của 2 chủng có phần đi xuống.
Hai chủng L1.2 và L1.3 đều phát triển tốt hơn khi được khuấy trộn so với không khuấy bởi vì nhờ khuấy trộn nên các vi khuẩn được tiếp xúc nhiều hơn với chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Khuấy trộn còn giúp cho các chất ức chế do chính vi khuẩn này sinh không bám dính vào vi khuẩn để gây ức chế trở lại. Ngoài ra, khuấy trộn cũng có tác dụng tăng hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn.Tuy nhiên ở tốc độ khuấy trộn cao thì sự
phát triển của 2 chủng có phần chậm lại có thể do tốc độ quá cao nên các hoạt động hấp thu dinh dưỡng, chuyển hóa có thể bị ảnh hưởng.
Qua thí nghiệm này, chúng tôi chọn tốc độ khuấy trộn là 180 vòng/phút cho quá trình nuôi cấy thu sinh khối để đảm bảo sự phát triển tốt nhất của cả 2 chủng trong môi trường nuôi.
3.3.5. Khả năng chịu mặn của hai chủng L1.2 và L1.3
Với mục đích ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotic cho nuôi trồng thuỷ sản. Do vậy, ta cần xác định khả năng chịu mặn của các chủng L1.2 và L1.3. Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS, pH 6.8 ± 0.2, nhiệt độ 34oC, tốc độ lắc 180 vòng/phút, ở các độ mặn khác nhau là 0%, 1%, 2%, 3%, 4% và 5% . Xác định nồng độ tế bào bằng phương pháp đo OD600 nm sau 21h nuôi . Kết quả được trình bày trên bảng 3.6 và hình 3.14.
Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng (OD600 nm) ở các nồng độ muối khác nhau của chủng L1.2 và L1.3 OD600 nm Nồng độ muối (%) Chủng 0 1 2 3 4 L1.2 2.53 2.5 2.47 2.46 2.36 L1.3 2.3 1.42 1.23 1.16 1.07
0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 1 2 3 4 5 Nồng độ muối NaCl (%) O D 6 00 n m L1.2 L1.3
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Kết quả cho thấy sự phát triển của 2 chủng tỷ lệ nghịch với độ mặn của môi trường. Chủng L1.2 có khả năng phát triển ở nồng độ muối NaCl đến 5%. Ở nồng độ này nồng độ tế bào đo được còn đến 88% so với trường hợp không bổ sung muối vào môi trường. Chủng L1.3 có khả năng chịu mặn yếu hơn chủng L1.2, nồng độ tế bào giảm dần ở các nồng độ muối cao hơn và đến 5% muối thì sự phát triển của chủng L1.3 rất yếu, nồng độ tế bào chỉ còn khoảng 40% so với nuôi trong điều kiện không bổ sung muối.
Hai chủng L1.2 và L1.3 có khả năng chịu mặn tương đối tốt bởi vì chúng được phân lập từ cá chim vây vàng sống trong môi trường biển (độ mặn trung bình của nước biển là khoảng 3%). Đặc biệt, khả năng chịu mặn của chủng L1.2 tương đối cao, chủng L1.2 có thể tồn tại và phát triển tốt ở nồng độ muối NaCl lên đến 5%. Khả năng chịu mặn cao của chủng L1.2 và L1.3 sẽ giúp cho các chủng có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường nước biển. Đây là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm probiotic cho NTTS ở các vùng biển khác nhau.
3.3.6. Khả năng sinh enzyme amylase và protease của hai chủng L1.2 và L1.3
Hai chủng L1.2 và L1.3 nuôi cấy trên môi trường MRS sau 21h, dịch nuôi cấy được đem ly tâm 8000 vòng/phút trong thời gian 15 phút và lấy dịch ly tâm cho vào các lỗ đã được đục sẵn trên môi trường cơ bản chứa các cơ chất tương ứng. Hoạt tính enzyme protease và amylase được xác định lần lượt trên môi trường cơ bản chứa lần lượt cơ chất là casein 1% và tinh bột 1%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng L1.2 và L1.3
Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 chủng L1.2 và L1.3 có hoạt tính enzyme rất thấp, không có hoạt tính enzyme amylase. Như vậy, nếu sử dụng 2 chủng L1.2 và