- Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ rầy (con/m2) sau 3,7 và 10 ngày sau gieo.
3.5 Phương pháp giám định virus
Mẫu cây và rầy được giám định virus bằng RT-PCR tại Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật thuộc Cục BVTV, dùng các bộ mồi sẵn có đã cơng bố cho virus là SRBSDV. Quá trình chiết RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR được thực hiện với các kít thương mại như TriZol (hãng invitrogen) dùng để chiết RnA, ReverseAid và DreamTaq (hãng Fermentas) dùng để thực hiện phản ứng RT-PcR
Phương pháp RT-PCR gồm các bước sau:
* Chiết RNA tổng số từ cây bệnh bằng Liti clorua (LiCl).
Bước 1: Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung β-Mercaptathanol (BME) với tỉ lệ 1ml đệm CTAB :10 µl BME trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút.
Bước 2 : Lấy 0,2g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi dung dịch thu được là một thể đồng nhất). hút 600 µl dịch
chiết vào tube 1,5 ml.
Bước 3: Li tâm 13000 vòng/phút trong 1phút, thu dịch trên tủa (500 µl), loại bỏ cặn.
Bước 4 : Thêm Chloroform : Iso amyl alcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tương đương. Đảo đều tube.
Bước 5 : Li tâm 13000 vịng/phút trong 10phút, thu dịch trên tủa (400 µl). Bước 6 : Lặp lại các bước 3, 4, 5 thêm một lần nữa.
Bước 7: Bổ sung LiCl 10M với thể tích bằng 1/4 dịch trong tube (100 µl). Đảo đều tube. Li tâm 13000 vịng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn RNA tổng số.
Bước 8 : Rửa cặn bằng Ethanol 70o hai lần.
Bước 9 : Làm khô cặn bằng cách mở nắp tube và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Bước 10 : Hịa cặn trong 50 µl nước cất vơ trùng và bảo quản trong tủ -80oC.
* phản ứng RT-PCR
Cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng:
RB-S10-F2: 5’TCCATAATGGCTGACATAAGAC3’ RB-S10-R2: 5’CATTTGAGCAGGAACTTCACG3’ Phản ứng RT-PCR Thành phần Lượng (µl) Chu trình PCR H2O dd khử trùng 9.8 2X Reaction Mix 12.5 50 oC 30’ 94oC 4’ X1 RB-S10-F2 0.5 RB-S10-R2 0.5 E mix 0.2 94oC 40’’ 52oC 40’’ 68oC 1’ X35 RnA 1 Tổng thể tích 24.5 68oC 5’ 20oC 5’ X1