3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu I- Cục Bảo vệ thực vật, Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội.
+ Xã Đơng Phong, Huyện Tiền Hải, Tỉnh Thái Bình - Thời gian nghiên cứu:
Đề tài được tiến hành vào vụ mùa 2010 đến vụ mùa năm 2011.
3.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
3.2.1 Cây thí nghiệm nhiễm bệnh
Các mẫu bệnh trên lúa bị bệnh lùn sọc đen phương Nam được thu thập từ các vùng bị bệnh nặng (tỷ lệ bệnh >20%) thuộc xã Đông Phong, huyện Tiền Hải, tỉnh Thái Bình. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo (LBNT) được tiến hành trên lúa giống Bắc Thơm số 7 (BTs7), môi giới truyền bệnh là rầy lưng trắng và được duy trì trong nhà lưới
3.2.2 Cây thí nghiệm sạch bệnh
Cây lúa, ngơ trước khi tiến hành thí nghiệm LBNT được gieo trồng tại khu nhà kính của Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu I - Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội.
3.2.3 Vector truyền bệnh
Rầy lưng trắng sạch bệnh do Bộ môn thuốc, Viện Bảo vệ thực vật cung cấp.
3.2.4 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dụng cụ phục vụ cho thu mẫu rầy và bố trí thí nghiệm gồm: cơng tơ hút rầy, ống tuýp sạch, lồng chụp mika, chậu vại cấy lúa, ống nghiệm, lồng chụp lưới, khay gieo mạ…
nhân gây bệnh trong phịng thí nghiệm bằng phương pháp RT-PCR:
- Đệm tách chiết RNA, cặp mồi đặc hiệu của SRBSDV, máy li tâm, máy PCR, máy điện di, máy đọc trình tự gen...
- Trình tự cặp mồi là:
RB-S10-F2: 5’TCCATAATGGCTGACATAAGAC3’ RB-S10-R2: 5’CATTTGAGCAGGAACTTCACG3’
Cặp mồi này tạo sản phẩm có kích thước dự kiến là 0.6 kb.
- Thiết bị phục vụ nghiên cứu gồm tủ lạnh sâu, tủ lạnh, kính lúp, máy đọc, máy đo PH, đầu côn các loại,…
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Điều tra diễn biến mật độ RLT và tỉ lệ bệnh LSĐPN
a) Diễn biến mật độ RLT
- Điều tra diễn biến về mật độ rầy lưng trắng trên các ruộng thí nghiệm tại Tiền hải, Thái Bình được thực hiện theo Tiêu chuẩn nghành 10 TCn 982: 2006 về Phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại lúa (Ban hành kèm theo Quyết định số 4094/QĐ-BNN-KhCn ngày 29/12/2006 của Bộ trưởng Bộ NN &PTNT). Định kỳ điều tra 7 ngày/lần theo phương pháp 5 điểm ngẫu nhiên trên 2 đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 khóm. Điểm điều tra cách bờ ít nhất 2m. Dùng khay (20 x 20 x 5 cm) dưới đáy khay có lớp dầu mỏng. Đặt nghiêng 1 góc 45o với khóm lúa rồi đập 2 đập, đếm số rầy vào khay rồi nhân với hệ số 2, nhân với số khóm trên 1m2. Ở giai đoạn lúa trỗ: Tại mỗi điểm dùng khay đập 10 khóm dưới gốc và 10 khóm trên bơng, đập 2 đập, đếm số rầy vào khay rồi nhân với hệ số 2, quy ra mật độ con/m2.
b) Diễn biến của bệnh LSĐPN trên ruộng thí nghiệm
- Điều tra định kỳ 7 ngày/lần theo Tiêu chuẩn nghành 10 TCN 982: 2006 về Phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại lúa (Ban hành kèm theo Quyết định số 4094/QĐ-BNN-KHCN ngày 29/12/2006 của Bộ trưởng Bộ NN
&PTNT) tại Tiền Hải, Thái Bình. Mỗi ruộng điều tra 5 điểm ngẫu nhiên trên 2 đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 10 khóm. Điểm điều tra cách bờ ít nhất 2m. Đếm toàn bộ số dảnh bị hại/số dảnh điều tra. Chỉ tiêu theo dõi : Tỷ lệ bệnh (%)
3.3.2 Xác định ảnh hưởng của mật độ RLT đến khả năng truyền virus LSĐPN LSĐPN
Bệnh LSĐPN hại lúa truyền bệnh theo kiểu bền vững tái sinh tức là cơn trùng mơi giới phải có đủ thời gian chích hút trên cây bị bệnh và sau đó phải có đủ thời gian (nhân virus trong cơ thể chúng) ủ bệnh mới có khả năng truyền bệnh cho cây lúa khỏe. Thời gian 10 ngày rầy chích hút cây lúa bệnh là khoảng thời gian ủ bệnh tối đa để đảm bảo cho thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo mang lại hiệu quả tốt nhất (Hà Viết Cường, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội).
Tiến hành thí nghiệm xác định ảnh hưởng của mật độ rầy lưng trắng
(Sogatella furcifera) đến khả năng truyền virus LSĐPN ở các mật độ: 1, 3, 5,
10 con/cây. Thí nghiệm được nhắc lại ba lần cho mỗi mật độ. Công thức đối chứng thả rầy lưng trắng tuổi 3 - 4 sạch bệnh, ở các mật độ: 1, 3, 5, 10 con/cây.
- Phương pháp lây nhiễm: Rầy lưng trắng tuổi 3 - 4 sạch bệnh được thả vào chậu lúa nhiễm bệnh, cho chúng chích hút trong 10 ngày. Sau đó chuyển sang cây lúa khỏe 7 – 10 ngày tuổi để lây bệnh với số lượng 1, 3, 5, 10 cá thể/cây, cho chúng truyền virus trong 2 ngày rồi đưa chúng ra khỏi chậu vại và tiến hành diệt trừ bằng thuốc hóa học Actara nồng độ 0,1%. Mỗi cây sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng, theo dõi sự sinh trưởng của cây lúa cho đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh
3.3.3 Xác định khả năng truyền bệnh LSĐPN cho thế hệ sau của RLT
Tiến hành thí nghiệm xác định khả năng truyền virus LSĐPN lại cho thế hệ sau của rầy lưng trắng (S. furcifera), nhằm đưa ra những dự báo và biện pháp phòng ngừa bệnh hiệu quả.
- Phương pháp tiến hành: Rầy lưng trắng sạch bệnh tuổi 3 được thả vào ống nghiệm chứa 1 cây lúa nhiễm bệnh, cho chúng chích hút trong 10 ngày. Sau đó tiến hành ni sinh học cho chúng đẻ trứng.
+ Tiến hành kiểm tra sự tồn tại của virus LSĐPN trong trứng của rầy lưng trắng nhiễm bệnh bằng phương pháp RT-PCR.
+ Tiếp tục nuôi sinh học trứng của rầy lưng trắng để chúng nở, nuôi tiếp để chúng phát triển thành rầy trưởng thành. Lây nhiễm nhân tạo chúng trên cây lúa sạch bệnh nhằm đánh giá khả năng truyền virus LSĐPN của thế hệ sau rầy nhiễm bệnh.
* Lây nhiễm cá thể: Rầy lưng trắng thế hệ sau được thả vào ống nhiệm chứa 1 cây lúa khỏe 10 ngày tuổi để lây bệnh với số lượng 1 con/cây/ống nghiệm, cho chúng truyền virus đến khi chúng chết. Cây lúa sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (tiến hành thí nghiệm trên 30 cây)
* Lây nhiễm tập thể: Rầy lưng trắng thế hệ sau được thả vào ống nghiệm chứa 1 cây lúa khỏe 10 ngày tuổi để lây bệnh với số lượng 10 cá thể/cây/chậu, cho chúng truyền virus đến khi chúng chết. Cây lúa sau khi lây nhiễm được cách ly bằng lồng lưới chống côn trùng đến khi biểu hiện triệu chứng bệnh (tiến hành thí nghiệm trên 30 cây)
3.3.4 Xác định khả năng truyền bệnh LSĐPN qua các pha phát dục của RLT RLT
Thí nghiệm được bố trí đối với rầy non tuổi 3, 4 và rầy trưởng thành. Mỗi công thức 1 con/cây, nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 chậu.
Phương pháp tiến hành: Rầy lưng trắng tuổi 3, 4 và rầy trưởng thành sạch bệnh được thả vào chậu cây lúa nhiễm bệnh, để rầy chích hút 2 ngày, sau đó chuyển sang chậu nhựa đã trồng 1 cây lúa khỏe ở giai đoạn mạ 7-10 ngày tuổi với số lượng 1 con/chậu, cho chúng truyền virus đến khi chết đối với rầy
trưởng thành và đến khi lột xác thành rầy trưởng thành đối với rầy non. Tiến hành diệt trừ rầy tuổi nhỏ đã vũ hóa trưởng thành sau khi tách ra khỏi chậu bằng thuốc Actara nồng độ 0.1%
3.3.5 Khả năng truyền bệnh virus LSĐPN của RLT ở các giai đoạn mẫn cảm của lúa cảm của lúa
Tiến hành trên các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa: (1) giai đoạn mạ, (2) giai đoạn đẻ nhánh, (3) giai đoạn đứng cái – làm địng. Mỗi giai đoạn bố trí 2 cơng thức: CT1. Lây bệnh nhân tạo, CT2. Đối chứng không lây bệnh. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 cây lúa.
CT1. Lây bệnh được tiến hành như sau: rầy lưng trắng tuổi 3 - 4 sạch bệnh được thả vào chậu cây lúa nhiễm bệnh, để rầy chích hút 10 ngày, sau đó chuyển sang cây lúa khỏe ở các giai đoạn khác nhau với số lượng 5 con/cây, cho chúng truyền virus trong 2 ngày sau đó tiến hành diệt trừ bằng thuốc Actara nồng độ 0,1%.
CT2. Đối chứng: tiến hành thả rầy lưng trắng tuổi 3 - 4 sạch bệnh vào chậu lúa sạch bệnh, để rầy chích hút 10 ngày, sau đó chuyển sang cây lúa khỏe ở các giai đoạn khác nhau với số lượng 5 con/cây, cho chúng truyền virus trong 2 ngày sau đó tiến hành diệt trừ bằng thuốc Actara nồng độ 0,1%
3.3.6 Khả năng truyền bệnh LSĐPN của RLT từ lúa sang ngô và ngược lại